辽东学院本科教案课程教案（ 2010—2011学年第二学期）课程名称：细胞生物学实验周学时：2教学周数：16授课班级：农业B0902任课教师：王丹丹农学院教案（首页）实验一显微镜的使用及显微摄影技术授课时数：（本次课学时数——2）教学课型：实验课一、教学目的与要求1．了解显微镜各部分的名称，结构和功能，学习普通光学显微镜，荧光显微镜，倒置显微镜等的构造和使用方法.2．掌握显微摄影的基本方法，学会显微镜的视差校正，曝光控制。
二、教学重点与难点1．了解显微镜各部分的名称，结构和功能，学习普通光学显微镜，荧光显微镜，倒置显微镜等的构造和使用方法.2．掌握显微摄影的基本方法，学会显微镜的视差校正，曝光控制。
三、实验原理：随着科学技术的发展，显微镜检方法由最传统的明视野、暗视野发展出了相差法、偏光方法；荧光方法也由透射光激发进展为落射光激发，使荧光效率大为提高；微分干涉相衬方法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱镜，使之能应用于医学与生物学的样品，又能应用于金相样品的分析与检验。
四、作业、讨论、实验（实训）、案例1.简述使用显微镜的注意事项；2.简述使用油镜的具体步骤？五、参考资料中国生物论坛/六、教学内容与教学过程（教学设计）提出本学期的学习计划及上课要求讲授本节内容一、课前准备二、讲解原理、步骤、注意事项及演示三、学生操作：实验方法与步骤1、普通光学显微镜的基本构造及使用方法；2、荧光显微镜的基本构造及使用方法；3、倒置显微镜的基本构造及使用方法；4、自动曝光显微摄影的方法。
七、课后小结实验二植物细胞骨架的光学显微镜观察授课时数：（本次课学时数——2）教学课型：实验课一、教学目的与要求通过对洋葱内皮细胞的处理，了解植物细胞骨架的结构特征及其制备技术与显微形态观察。
二、教学重点与难点了解植物细胞骨架的结构特征及其制备技术与显微形态观察。
三、实验原理：细胞骨架在细胞中呈由蛋白纤丝交织成的立体网状结构，并且处于动态变化中。
细胞骨架在胞质、细胞核、质膜、胞壁中都有分布，参与细胞形态维持、物质运输、信号转导等作用。
处于不同生理状态的细胞其细胞骨架有变化，可根据细胞骨架推测细胞所处生理阶段。
四、作业、讨论、实验（实训）、案例3.绘制你所观察到的植物细胞骨架图象；4.戊二醛、考马斯亮兰R250、TritonX-100是什么？在本实验中各起什么作用？五、参考资料中国生物论坛/六、教学内容与教学过程（教学设计）提出本学期的学习计划及上课要求讲授本节内容一、课前准备二、讲解原理、步骤、注意事项及演示三、学生操作：实验方法与步骤5、撕取洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm2大小若干片）置于装有pH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉；6、吸去pH6.8磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20min；7、吸去1% TritonX-100，用M-缓冲液洗三次，每次8min；8、3%戊二醛固定30min；9、pH6.8磷酸缓冲液洗三次，每次8min；10、0.2%考马斯亮兰R250染色20min；11、用蒸馏水洗1-2次，将内表皮细胞平铺子载玻片上，加盖玻片，于显微镜下观察。
七、课后小结实验三 DNA的细胞化学——Feulgen反应授课时数：（本次课学时数——2）教学课型：实验课一、教学目的与要求了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。
二、教学重点与难点Feulgen反应的原理及有关的操作方法。
三、实验原理：自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。
其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA 分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。
Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。
也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。
其反应机制如下图所示。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3四、作业、讨论、实验（实训）、案例1、简述Feulgen反应的原理和实验的关键步骤。
2. 绘图示洋葱根尖细胞或鳞茎表皮细胞DNA的分布部位。
五、参考资料中国生物论坛/六、教学内容与教学过程（教学设计）课前提问复习上节细胞的内容，引入新课讲授本节内容一、课前准备二、讲解原理、步骤、注意事项及演示三、学生操作：实验方法与步骤1．将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1N HCl中，加热到60℃水解8～10 min。
2．蒸馏水水洗。
3．Schiff试剂遮光染色30min。
4．用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1min。
5．水洗5min。
6．将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。
7．显微镜检查。
结果：细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。
对照片：方法一：先将材料放在5%三氯醋酸中90℃水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后按步骤1—7制片观察。
方法二：材料不经1N HCl水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤4—7制片观察。
七、课后小结实验四细胞膜的通透性授课时数：（本次课学时数——3）教学课型：实验课一、教学目的与要求了解相对分子质量、脂溶性大小、电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响。
二、教学重点与难点了解相对分子质量、脂溶性大小、电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响。
三、实验原理：细胞膜在不断变化的环境中，必须保持自身的稳恒状态，才能生存。
细胞膜允许一些物质通透，又能降低甚至阻挡另一些物质的通透，所以细胞膜具有选择通透性。
水分子可以自由通过细胞膜，当细胞处于低渗液环境时，水分子大量渗到细胞内，使细胞膨胀，进而破裂，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这就是溶血现象。
溶血现象可作为测量物质进入红血细胞速度一种指标。
溶血现象发生的快慢与进入细胞的物质的分子量大小有关。
相对分子量大的进入细胞慢，发生溶血所需时间也长。
非极性化合物易溶于脂溶剂，但在水中溶解度很小。
碳链越长，脂溶性越大。
各种非电解质溶液，只要单位面积中所含的分子数相同，就具有相同的渗透压。
电解质溶液，如NaCl与葡萄糖分子数相等时，NaCl产生的渗透压要大得多。
四、作业、讨论、实验（实训）、案例简述相对分子质量、脂溶性大小、电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响。
五、参考资料中国生物论坛/六、教学内容与教学过程（教学设计）课前提问复习上节细胞的内容，引入新课讲授本节内容一、课前准备二、讲解原理、步骤、注意事项及演示三、学生操作：实验方法与步骤1. 相对分子质量大小对膜通透性的影响（1）将编号的三支试管中，分别用吸管吸入2ml l mol/L乙二醇、l mol/L丙三醇溶液、l mol/L葡萄糖高渗液。
（2）先后用注射器滴加两滴血液，用手指按住管口，倒置一次。
（3）观察溶血时间，最长延至10min。
（42. 脂溶性大小对膜通透性的影响（1）将编号的三支试管中，分别用吸管吸入2ml 3 mol/L甲醇、乙醇、丙醇。
（2）先后用注射器滴加两滴血液，用手指按住管口，倒置一次。
（3）观察溶血时间。
（43. 电解质和非电解质对膜通透性的影响（1）将编号编号，著名溶质名称及物质的量浓度。
（2）按编号分别加入不同浓度的葡萄糖及氯化钠溶液2ml。
（3）每管各滴加两滴血液，用手指按住管口，倒置一次。
（4）室温放置15min，观察发生溶血的浓度，确定等渗浓度。
（5）按下表记录实验结果。
（6七、课后小结实验五动物骨髓细胞染色体标本的制备授课时数：（本次课学时数——3）教学课型：实验课一、教学目的与要求掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术；观察染色体的数目以及形态特征。
二、教学重点与难点动物骨髓细胞染色体标本的制备。
三、实验原理：骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球凝集素（PHA）的刺激，可直接观察到分裂细胞。
经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本，是研究动物细胞遗传学的好材料。
骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在一般的实验室均可进行。
四、作业、讨论、实验（实训）、案例问题讨论1. 通过这次实验，你认为实验中要注意哪些问题？2. 分析你做得标本的优劣，绘出绘出骨髓细胞分裂中期染色体核型图，指出染色体数目2n等于多少？五、参考资料中国生物论坛/六、教学内容与教学过程（教学设计）课前提问复习上节细胞的内容，引入新课讲授本节内容一、课前准备二、讲解原理、步骤、注意事项及演示三、学生操作：实验方法与步骤1．秋水仙素处理：实验前3～4小时，按动物每克体重2～4μg的剂量，腹腔注射秋水仙素。
2．取股骨：处死动物后，立即取出股骨，用刀片剔掉肌肉。
3．收集骨髓细胞：用刀片剪开股骨的两端，用盛有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，直至股骨变白色为止。
将收集的骨髓细胞平衡后放入离心机，以1000r/min 离心10min.4．低渗处理：弃上清液，加入6ml蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，置37℃温箱中低渗20min 。
5．预固定：加入5滴新配的固定液，立即打匀，并以1000r/min 离心10min 后，弃上清液。
6．固定：沿管壁慢慢加入6ml固定液，立即用吸管吹打成细胞悬液，室温下固定20min.。
1000r/min 离心10min后弃上清液。
7．重复步骤6的操作。
8．沉淀物中加入0.3～0.5ml固定液，用吸管吹打成细胞悬液。
9．滴片：用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2～3滴细胞悬浮液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥。
10．染色：将晾干的玻片放在洁净的玻板上，用Giemsa染液（Giemsa原液用10倍体积的1/15M磷酸缓冲液（pH7.4）稀释）染色30min，自来水冲洗，空气干燥。
11．镜检。
在低倍镜下找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散适度、长度适中的分裂相进行观察。
七、课后小结实验六原生质体的分离和培养授课时数：（本次课学时数——3）教学课型：实验课一、教学目的与要求掌握原生质体的分离、提纯和培养技术，观察原生质体再生壁和细胞分裂过程。
二、教学重点与难点原生质体的分离、提纯和培养技术三、实验原理：植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。
其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。