陇东学院生命科学与技术学院本科学士学位论文开题报告题目：大肠杆菌噬菌体分离纯化研究学院：生命科学与技术学院专业：生物科学班级： 10级生科（1）班姓名：郑小云指导教师：毛宁2013 年 5 月 1日大肠杆菌噬菌体分离纯化研究一、选题依据1、选题目的噬菌体是一类感染细菌、放线菌、真菌等微生物的病毒，体积微小、结构简单、具有严格的寄生性，广泛存在于自然界的各个角落，包括河水、土壤、污水以及健康人的机体中。

噬菌体作为指示微生物，在监测水质环境、指示污染程度等方面的研究有非常重要的作用。

因此，分离和研究噬菌体，弄清噬菌体与其宿主之间的生态学关系，对于监测水质环境，控制水质污染等方面的工作无疑具有重要指导意义。

大肠杆菌噬菌体，是指寄生在大肠杆菌内的一种噬菌体，属于细胞病毒的一种，具有专一性,一种噬菌体只在一种细菌中生活,而不能在另一种细菌中生活。

它主要存在于一些动物的粪便和污染水源中，肠出血性大肠杆菌引起的疾病症状包括腹部绞痛和腹泻，一些病例可能发展为血性腹泻（出血性大肠炎）。

潜伏期3至8天，平均为3至4 天。

大多数病人10天内康复，但是有少数病人（特别是幼儿和老年人）的染病可能发展为威胁生命的疾病，例如溶血尿毒综合症（HUS）。

溶血尿毒综合症的特点是急性肾衰竭、溶血性贫血和血小板减少。

据统计63%至85%的病例是由于通过食物感染病菌的。

大肠杆菌噬菌体是一种可以感染大肠杆菌并且在大肠杆菌体内复制繁殖的病毒，当其感染大肠杆菌后，便会破坏大肠杆菌的细胞结构以及引起细菌致死，待大肠杆菌死亡之后，繁殖的大量噬菌体便会冲破死亡大肠杆菌，再去感染别的大肠杆菌，最终引起大肠杆菌的大范围死亡。

鉴于噬菌体有溶菌作用和严格的种型特异性，可利用噬菌体作细菌的鉴定和分型，亦可用于检测标本中的未知细菌和防治某些传染病。

噬菌体作为一种新的治疗制剂已受到广泛关注[ 1]，本实验旨在通过分离大肠杆菌噬菌体, 研究其生理特性，为噬菌体作为一种生物制剂用于治疗细菌性感染提供实验依据。

为预防和治疗大肠杆菌感染引起的疾病探索一种极为有效的方法。

2、选题意义通过这个实验我们可以研究清楚大肠杆菌噬菌体各方面的生理特性，以及大肠杆菌噬菌体与大肠杆菌的关系，可以探究出大肠杆菌噬菌体感染大肠杆菌的最佳条件，测出大肠杆菌噬菌体的效价和最佳感染复数，对于利用大肠杆菌噬菌体治疗大肠杆菌引起的疾病方面的研究提供实验依据，这样可以为大肠杆菌感染患者做出一份贡献，帮助他们早日康复，不受病菌的折磨。

通过这个实验题目让我将所学的生物专业课程应用到实验中去，在实验过程中总结和运用四年所学的知识；同时也通过实验过程复习有关实验的基础知识和基本操作方法，锻炼实验操作能力，为以后工作打下坚实的基础。

3、国内外研究现状英国细菌学家和内科医生Frederick Twort和法裔加拿大细菌学家FlixDHerelle分别在1915年和1917年独立发现了噬菌体，不久之后就用来治疗感染性疾病。

dHerelle最早从来自痢疾的临床样本研究中观察到噬菌体滴度的增加正好伴随着病人的康复过程。

他将噬菌体称为“外源性免疫因子”[2] 。

1934年美国科学家报道了利用噬菌体疗法治疗肠球菌感染的成功率可达80% [3] 。

但随着抗生素的成功推广应用，二次世界大战之后美国和西欧的大多数国家都终止了噬菌体制剂的研制。

近年来细菌耐药性问题不断突现，用抗生素治疗细菌感染面临巨大的挑战，一些科学家和临床工作者开始重视噬菌体制剂的研制。

研究者Harper解释了为什么噬菌体疗法现在又被重新使用起来了，因为每一个噬菌体对某种类型的细菌有高度的特异性，而且它们需要正确的宿主细胞才能够进行复制。

靶细菌越多，噬菌体的繁殖速度越快，越能在最短时间内杀死细菌。

因此用噬菌体来治疗大量细菌的感染性疾病变得有可能，比如慢性耳朵感染、肺部感染以及伤口感染等。

研究者还表示，对于多种类型的细菌感染，仅仅需要一点点噬菌体就可以治疗感染性疾病。

而且我们可以直接用噬菌体型的喷雾剂、滴液或者膏状物来治疗感染，当然了，最主要的好处是噬菌体不会感染人类的细胞，从这点来说，噬菌体治疗方法对于治疗人类的细菌性感染疾病变得非常安全。

近年来，日益增加的细菌抗生素耐药性对于我们治疗感染来说越来越困难，而且新型抗生素研发的速度远远赶不上耐药细菌出现的速度。

目前研究者正在加速研究噬菌体治疗细菌感染这种疗法。

目前，噬菌体疗法的临床试验正在进行之中，第一例临床安全试验是2005年进行的，相关试验结果于2009年已经发表出来了，结果证实了噬菌体疗法的有效性和安全性。

研究由Ampliphi公司进行，一旦临床试验成功后，未来，噬菌体的治疗方法将会彻底治疗细菌感染以及细菌的耐药性。

二、研究的主要内容及预期目标1、研究的主要内容本实验运用噬菌斑法从环境污水中分离鉴定大肠杆菌噬菌体并进行纯化，先培养大肠杆菌至对数期，取大肠杆菌培养液于牛肉膏蛋白胨培养基中，加入经离心并过滤除菌的污水样，37℃摇床培养以增殖噬菌体；然后将以上培养液3000r/min离心30min，将上清液过滤除菌，取100ml滤液及5ml大肠杆菌液加入50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃培养12~18h进行噬菌体富集；重复上述富集方法两次后进行噬菌体的收集、验证噬菌体的存在、纯化大肠杆菌噬菌体，得到纯化的大肠杆菌噬菌体后测定大肠杆菌噬菌体的效价、最佳感染复数和一步生长曲线。

2、预期目标感染复数是为研究病毒感染与产出之间量效关系而提出的一个重要生物学指标。

不同噬菌体的最佳感染复数不同, 测定一个特定噬菌体的最佳感染复数对噬菌体颗粒的分离纯化、结构蛋白的制备、基因组的提取以及噬菌体呈现技术等研究有指导意义[ 4,5]。

本实验预期能从污水中分离出大肠杆菌噬菌体。

富集之后进行分离纯化，从而可以测出噬菌体的效价、最佳感染复数和一步生长曲线。

为进一步研究噬菌体的生理特性提供实验依据。

三、研究方法1 材料与仪器用品1.1材料噬菌体样品：阴沟污水（100ml），土壤菌种：大肠杆菌培养基： 3倍牛肉膏蛋白胨培养液（4瓶，每瓶50ml），牛肉膏培养液，牛肉膏蛋白胨半固体培养基（倒上层用），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（倒底层平板用）1.2培养基及培养液的配制按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。

牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。

也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。

另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。

溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。

待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。

如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。

最后补足所失的水分。

在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。

反之，则用1mol/L HCl进行调节。

注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。

对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行，然后进行过滤分装就可以了。

1.3仪器设备离心机，细菌滤器，抽滤装置，恒温水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，无菌涂布器，无菌吸管，培养皿，三角瓶，移液管，试管，漏斗等2方法步骤2.1大肠杆菌噬菌体的分离及噬菌斑的观察2.1.1培养大肠杆菌培养大肠杆菌至对数期600nm（OD值0.8左右）2.1.2增殖噬菌体样品取上述大肠杆菌培养液6ml于盛有50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，后加入污水样100ml（离心并过滤除菌），继续37℃摇床振荡培养12～14h，以增殖噬菌体。

2.1.3富集噬菌体将以上培养液3000r/min离心30min，将上清液过滤除菌，取100ml 滤液及5ml大肠杆菌液加入50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃培养12～18h进行噬菌体富集。

将以上富集液3000r/min离心30min后，取上清液10mL加入 5mL 3×倍牛肉膏蛋白胨培养液及相应宿主菌液1mL，室温下放置 1h，37℃ 120rpm振荡培养 3.5h。

2.1.4验证噬菌体存在2.1.4.1双层琼脂平板法倒下层琼脂：融化下层培养基，倒平板（约 10mL/皿）待用。

倒上层琼脂：融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至 50℃左右时，每管中加入敏感指示菌 (大肠杆菌) 菌液 0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液 0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。

恒温培养：30℃恒温培养 6～12h观察结果。

如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑──噬菌斑。

2.1.4.2 单层琼脂平板法省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至 45℃左右，如同上法加入指示菌和检样，混合后迅速倒平板。

30℃恒温培养 6～16h后观察结果。

2.1.5收集噬菌体将上述培养液于 4℃下 12000g 离心 30min，上清液再经微孔滤膜（0.22μm）过滤，滤液即为拟含有相应宿主菌噬菌体的原液。

2.2大肠杆菌噬菌体纯化(1)用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1ml大肠杆菌悬液，使混合均匀。

(2）取上层琼脂培养基，溶化并冷至48℃（可预先溶化、冷却，放48℃水溶箱内备用）,加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2ml，立即混匀，并立即倒人底层培养基上，混匀，置37℃培养12h。

(3）此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。

于 37℃培养。

（4）等待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。

2.3噬菌体效价的测定2.3.1 倒平板将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。

2.3.2 稀释噬菌体按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5mL1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。

2.3.3 噬菌体与菌液混合将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。

分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。