其中一种变株所不能合成的中间物，可由 另一种能积累该中间物的变株所提供，从 而使抗生素合成的一系列反应得以进行。
所积累的产物可以被分离和鉴定
为证实这些产物的确是生物合成途径的中间 产物，可以通过原始出发菌株，由这些中间 产物转变为终产物的实验以进行评价。
例如，我们可以将中间产物加入到产生菌的 细胞悬浮物中，几小时后，测定其中抗生素 的生成量，再与对照组中合成抗生素的量进 行比较。
(2)乙酸中的羧基碳缩合成丙二酸的亚甲基碳；与此同时， 丙硫脂二酶酸作的用自下由与羧A基C以P相CO连2接的。形式失去，形成乙酰乙酸，在
(3)乙酰乙酸中的酮基被还原为羟基。随后脱水产生一个双 键，该双键在第二步还原反应中被饱和生成丁酸酯部分。
(4)延伸中的链被转移到缩合酶，另一个丙酸单位与ACP连 接，反应重复进行，直至达到适合的链长。由硫脂酶将该 脂肪酸释放出去。
13C标记前体
在利用13C标记前体时，掺入单个原子的情况可以 通过产物的核磁共振(NMR)光谱来显示。
利用这项技术，分子中单个碳原子在共振光谱中以 高峰出现，其高度与其中13C的含量几乎成正比。
标记物的渗入度可由所标记分子的峰值与天然产物 的峰值之比来表示(13C的天然富足度为1.1％) 。
第六章 抗生素的生物合成 及产生的遗传学
第一节 研究方法
完整地阐明生物合成过程应包括： (1)促成分子建成的初级代谢物结构单元的确立。 (2)代谢途径中中间产物的分离；这些产物的结构可
能会提供关于反应次序问题的合理假设。 (3)催化每一个反应的酶的鉴定。 (4)操纵基因及其序列和组成的确定。
确定生物合成基因两种不同策略
1．将某种抗生克隆。从这些抗性克隆中分离出编码自身抗性 的基因，然后可以着手分离侧翼的结构基因。
2．利用在相类似的生物合成途径中功能相似的基 因通常具有的高度的同源性，可将相类似的生物合 成途径的基因进行杂交。
一、追踪技术
为确定相应的结构单元，将所设想的抗生素前体 用14C，3H或13C等同位素标记，再将其加入到产 生菌的培养物中，最好是在生长后期加入。
经过一段时间的培养后，提取其中相应的抗生素， 纯化，检测所掺入的同位素。
在使用放射性同位素进行标记的过程中，常常需 要对分子进行化学降解，以确定放射性同位素所 掺入的组成该分子的原子。
分子常为小的分支的脂肪酸，并且还形成 15～17个碳的分支脂肪酸。 另外，还常伴随有一步还原反应被省掉， 形成线性不饱和脂肪酸。
聚酮类抗生素合成的聚合反应不同点
聚酮类抗生素合成的聚合反应过程还由两 种类型的合成酶所催化：多功能酶I型聚酮 亚甲基合酶(PKS I)和多酶复合物II型聚酮 亚甲基合酶(PKS II)。
在脊椎动物和酵母中，FAS是含有两个亚 基(I型FAS)的大的多功能酶；而在细菌和 较高等的植物中，则是一个多酶复合体， 可被分解为七个以上不同的酶(II型FAS)。
脂肪酸聚合反应的几个必要的步骤
(1)作为乙酸起始物分子和作为丙二酸延长单位与合成酶如 硫脂酶相连接：乙酸与缩合酶亚基(或区域)相连接，而丙 二酸与酰基载体蛋白(ACP)相连接。
(2)肽类抗生素，由氨基酸缩合而成，其过 程与聚酮体合成的过程相似。
(3)类异戊二烯类抗生素，由多个异戊二烯 单位缩合而成。
(4)氨基糖苷类抗生素，由多个糖单位聚合 而成，类似于多糖的合成过程。
一、初级代谢与次级代谢的关系
次级代谢物的大量生成与细胞的初级代谢 相比发生了相当大的变化。这种变化体现 在要为次级代谢物的生成提供物质和能量 (ATP)以及还原性辅酶。
将产抗株(尤其是高产突变株)与不产抗株 作比较，二者中与抗生素生物合成并无直 接关系的酶的水平也可能存在实质性的不 同。
二、抗生素“家族”的合成
一个微生物株系常常会产生几种代谢物，这些代 谢物在其化学结构与生物学活性上相类似，因而 共同组成一个抗生素“家族”。
家族化合物的生成并不仅仅局限于抗生素类，而 是次级代谢的一个普遍特征，这一特征归因于酶 对相应底物缺乏特异性。事实上，酶通常只识别 底物分子的特异区。结构非常相似的比较大的分 子，在与酶促作用位点无空间关系的区域内，存 在一些细小的差异。这些大分子物质在相应的反 应中，会被酶当作底物而识别。
叶酸
O H 5
3 4 N6
N
C H 2 N
2 H 2N N N 7
H
18
C O N H C H C H 2C H 2C O O H C O O H
蝶啶焦磷酸酯
对氨基苯甲酸 谷氨酸
蝶啶焦磷酸酯
对氨基苯甲酰谷氨酸
相似代谢物的聚合
(1)来源于聚酮体合成的抗生素。其聚合反 应机制与脂肪酸合成反应的机制相类似。
转氨基
霉
阻
断
对氨基苯丙酮酸
变
株
全
素 的 生
部 中 羟基化
物

间 产
合
物 的
成
方
法
还原
氧化
酶已被鉴定
C
( )
谢氨这 中基种 只出产 有现物 对在的 位苯一 或甲个 邻酸与 位羧众 氨基不 基的同 苯间的 甲位特 酸上征 。在初级代，是有一个
12 3
2 13
重排
-H2O
-H2O
成安
中莎
关霉
键素
的和
中丝
间裂
第三节 初级代谢产物向抗生素 或抗生素组成部分的转化
一、与氨基酸代谢有关的生物合成途径 二、与核苷酸代谢有关的生物合成途径 三、与辅酶代谢有关的生物合成途径
一、与氨基酸代谢有关的生物合成途径
一些抗生素，或一些大分子抗生素的组成 部分，来源于氨基酸合成代谢或分解代谢 的中间产物。
由
氯
分 离
生物合成基因确定后，将其核苷酸序列与数据库中 已知的序列进行比较，可以揭示出基因产物的功能 和特性，即其酶促作用和调节机能。而且，所推断 的酶的氨基酸序列可能有助于我们了解生物合成反 应的机制。
第二节 生物合成反应与途径
合成抗生素的酶促反应与生成初级代谢产 物的中间代谢并非有根本的不同。
事实上，催化特殊代谢物合成的酶是由普 通代谢中的酶进化而来。
克拉维酸的生物合成途径
精氨酸
环化 环化
β位羟基化
二、与核苷酸代谢有关的生物合成途径
具有核苷类结构的抗生素是经过与核苷酸 合成有关的途径，或通过常见核苷的修饰 作用而生成的。
核苷酸合成的途径
1. 从头合成。 2. 通过一种称为“补救途径”的方式合成。
这种补救途径包括外源嘌呤或嘧啶碱基的 核糖基化作用。 有几种抗生素是从修饰常见的核苷或核苷 酸而生成的。
三、酶的鉴定
通过比较产抗生素株与不产抗生素变株中酶 的活力，有时可以获取有关生物合成途径的 一些信息。
产抗生素株中一种酶活力的存在，与阻断变 株中该酶的缺失，即可有力地证明这种酶在 该生物合成途径中起着重要的作用。
在示踪技术和中间物的分离技术为生物合成 次序的确定提供足够信息的基础上，有可能 从酶的角度来研究单个合成反应。
2-13C标记的乙酸掺入替考拉宁
(A)通过常规发酵得出的替考 拉宁13C-NMR光谱(δ20125 ppm带)； (B)通过[213C]标记的乙酸掺入发酵所得 出的替考拉宁的光谱。可以看 出，乙酸是二羟苯甘氨酸部分 (小圆点)和脂肪酸链(大圆点) 的前体物质。
2H标记前体物分子中两个相邻的原子
阻断变株可通过对产生菌进行诱变处理，然后分 离出那些不具有产生抗生素能力的菌落而获得。
将这些变株一次两个在同一摇瓶内培养，发酵液 进行抗菌活性的测定。
两种不同的突变株进行共培养
突变株单独培养时不能产生抗生素，但将 两种不同的突变株进行共培养时，则可以 产生抗生素，表明这两种突变株的突变发 生在生物合成途径中的两个不同的阶段。
抗生素生物合成的途径可分两大类
１．对初级代谢产物的修饰反应。
这类反应与初级代谢物的合成与分解反应相类似， 例如象氨基酸或核苷酸的代谢反应。这些反应的 产物可以是一种抗生素，或者是一种结构较为复 杂的抗生素的组成成分。在初级代谢物中，有的 分子由两个或两个以上的单位组成，如叶酸或辅 酶A等。 2．相似代谢物的聚合。 通过这些反应，通常是先形成复杂而又关键的中 间物，然后经过进一步修饰，生成具有活性的终 产物分子。
以此起始经一系列反应完成的。
OH 5
3 4 N6
N
CH2 N
2 H2N N N 7
H
18
叶 酸
O
CONHCHCH2CH2COOH HN
N
COOH
H2N N N H
PPPR
鸟 嘌 呤 核 苷 三 磷 酸
核苷类抗生素，包括一些杀结核菌素，如丰加 霉素与蝶啶生物合成的相似性。
核糖是完成蝶啶和抗生素分子两者合成所需要 的三个碳原子的供体。
阿糖腺苷的合成
氧化
烯醇化
还原
酮基
阿糖腺苷是通过2’－羟基腺苷的差向异构比作用而合成
嘌呤霉素的生物合成
氨基化
酪氨酸 酰胺化
乙酰化
腺嘌呤核苷 3’—氨基—3’—脱氧腺苷
N-甲基化
O-甲基化
去乙酰化
失活作用
嘌呤霉素
三、与辅酶代谢有关的生物合成途径
叶酸中的蝶啶部分及核黄素的合成，是以甲酸 的形式，将鸟嘌呤核苷三磷酸第八位碳去掉，
对核磁共振光谱峰及其偶合常数的多重性的高分辨分析， 可以揭示出两个原子是否在整个代谢过程中都连结在一 起，还是保持相对独立，或是通过不同的代谢途径掺入 的。
通过利用氘标记的前体物的NMR的研究，同样可以获取 重要的信息。与氢不同，氘在NMR中不会产生质子的共 振信号。在生物合成反应机制的研究中，氘作为一种特 殊的标记物质，在生物合成过程的反应位点上取代单个 或多个氢原子。
四、遗传学与重组DNA技术