结核分枝杆菌固体培养操作流程
1
痰标本中加入 1-2倍体积 4%NaOH
2
涡旋振荡 1分钟
3
室温静置 15分钟
第3天、7天、此后每周 观察一次直至第九周, 记录菌落生长和污染
6
分别接种0.1ml
置37C温
前处理液至2
箱培养 只酸性罗氏培养基斜面
5
4
结核分枝杆菌固体培养操作流程 操作
痰标本
1－2倍 4% NaOH
No. of sputa tested n=41
n=41 n=36
培 100 养 80 阳 性 60 比 40 例
20
0
90
81
100
100
100
90
81 90
73
100
90
100
94
81
63
77
29
4C
10
25C
25
15
25-30C
0
0
3
7
14
21
28
标本保存时间（0,3,7,14,21,28天） Kim SJ, et al, 1986
特点：全自动、全封闭、快速、样本量 大 原理：分枝杆菌对NaOH的耐受性；分 枝杆菌在液体培养基生长更快，添加了 丰富的营养物质；分枝杆菌生长耗氧， 荧光增强，仪器自动探测荧光的变化。 试剂组成：MGIT培养管、MGIT生长 添加剂、PANTA杂菌抑制剂、SIRE药 敏试剂。 标本适用范围：除血液标本以外的所有 标本
结核分枝杆菌药敏试验-比例法
• 抗结核药物效价的计算：
效价 =纯度×活性成分×（1－水份含量） 实例：KM纯度99%，水分3.3%，活性成分69.6%
KM效价=99%×69.6%×（1－3.3%） =0.6663
保存 异烟肼和可以在室温保存（干燥器）；二氢链霉素/乙 胺丁醇必须在4℃保存；利福平必须在－20℃保存
9
6
瘰疬分枝杆菌
5
7
蟾蜍分枝杆菌
5
8
缓黄分枝杆菌
4
9
新金分枝杆菌
3
10
外来分枝杆菌
3
11
三重分枝杆菌
3
12
马赛分枝杆菌
2
13
亚洲分枝杆菌
2
14
堪萨斯分枝杆菌
2
25.23 24.62 18.62 18.62 2.70
1.5 1.5 1.2 0.9 0.9 0.9 0.6 0.6 0.6
结核分枝杆菌药敏试验-基于固体罗氏培养 基础上的方法
• 分枝杆菌培养阳性（菌落数）：菌落生长不足斜面面积1/4者
• 分枝杆菌培养阳性（1+）： 菌落生长占斜面面积的1/4
• 分枝杆菌培养阳性（2+）： 菌落生长占斜面面积的1/2
• 分枝杆菌培养阳性（3+）： 菌落生长占斜面面积的3/4
• 分枝杆菌培养阳性（4+）： 菌落生长布满整个斜面
分枝杆菌快检测系统（BACTEC960 系统）
盐水，用无菌吸管尖端或接种环刮取2-3周的新 鲜菌落，置于磨菌瓶中。注意尽可能刮取多处 的菌落。旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上混旋1分钟。 加入少许灭菌的PBS或生理盐水。 • 将悬浊液转移至比浊管中，加生理盐水或 PBS，其浊度与标准麦氏比浊管（MacFarland No.1）一致，即得到1mg/ml的菌悬液。
'0 '1
5% oxalic acid 5% oxalic acid
'5 '10 '15 '20 '30 '40 '60
Ex posure time(min)
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 '0
M. scrofulaceum M. kansasii
1% NaOH 2% NaOH 5% oxalic acid
钾、硫等）、生长因子 • 耐酸耐碱：对一定浓度的强酸强碱具有耐受性
结核分枝杆菌的生长特性
• 生长缓慢：在一般培养基上生长繁殖一代 需要10多小时，一般10-30天肉眼可见菌 落生长。
• 菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、 致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花 样，浅黄色或米色，不透明。
• 液体培养基（不含吐温-80）：絮状或颗 粒状沉淀。
结核分枝杆菌药敏试验-MGIT960法
特点：全自动、全封闭； 快速、样本量 大； 联合 （SIRE）药敏，可进行 PZA药敏试验；结果仪器 自动判读。
结核分枝杆菌药敏试验-MGIT960法
结核分枝杆菌快检测系统 （BACTEC960系统）
结核分枝杆菌药敏试验-试验器材试剂
• 生物安全柜 • 电子灭菌器 • 涡旋振荡器 • 恒温培养箱 • 无菌吸管 • 无菌生理盐水 • 0.5%吐温-80生理盐水（无菌） • 磨菌瓶（无菌） • 试管架 • 对照、鉴别、含药培养基
绝大部分非结核分枝杆菌能将对硝基-苯甲酸（PNB ）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸（PABA），而 绝大部分（98%以上）MTBC缺乏对硝基-苯甲酸（PNB ）还原酶活性，为对氨基-苯甲酸（PABA）将对硝基苯甲酸（PNB）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸 （PABA） • 局限：鉴定周期长15天-30天，特异性不高
结核分枝杆菌药敏试验-比例法
• 纯培养、生长活跃的结核菌作为测试 (2 – 4 周). 如果生 长不充分 (少于20 菌落, 1+), 不能很好的解释DST结果
• 少量菌代表病人体内所有菌生长情况 • 以H37Rv 作为对照，新鲜传代
结核分枝杆菌药敏试验-比例法
操作流程：
• 含药培养基的制备 • 菌液制备和稀释 • 接种 • 培养 • 报告结果
'5 '10 '15 '20 '30 '40 '60
Ex posure time(min)
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
利用固体罗氏鉴别培养基的鉴别：
中性罗氏 培养基
+
噻吩-2-羧酸 肼TCH
+
对硝基苯 甲酸PNB
+
菌型鉴定 NTM
+
+
-
人型Mtb
+
-
-
牛型Mtb
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
• 原理：硝基苯甲酸还原酶机制
Paramasivan CN, et al, 1983
不同浓度的酸碱对分支杆菌的影响
Percentage survival Percentage survival
100
M. tuberculosis
90
M. fortuitum
80
70
60
50
1% NaOH
40
30
2% NaOH
20
10
01% NaOH
4856
4415 90.9% 441 9.1%
L-J法
2447
2360 96.4 87 3.5%
结核分枝杆菌药敏试验-菌种鉴定
临床数据-2. 2016年湖南省胸科医院333株NTM的菌种鉴定结果
鉴定结果
例数
构成比（%）
1
胞内分枝杆菌
84
2
龟分枝杆菌
82
3
戈登分枝杆菌
62
4
鸟分枝杆菌
56
5
偶发分枝杆菌
2.比例法（WHO推荐方法） Canetti , 1963
临界药物浓度（单个药物浓度度μg/ml ） ）：SM 4；INH0.2； RFP40；EMB2；PAS1；OFX2；KM30；AMK30；CPM40； TH1321 40 临界菌群比＝耐药菌群数/全菌群数（ 1% ）
菌液浓度10-2mg/ml， 10-4mg/ml，接种量0.01ml
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
基于结核分枝杆菌特异分泌蛋白MPB64抗原的快 速检测鉴定技术
原理：1）MPB64是结核分枝杆菌中特有的分泌蛋白
由RD2区RV1908基因编码，保护228个氨基酸，相对 分子量24000 ；2）通过该蛋白制备的单克隆抗体
3）免疫层析法检测MPB64，鉴定结核分枝杆菌 适用样本：MGIT960等液体及改良罗氏培养基等固体培养
质量控制
2、污染率
污染的培养管数量 = ———————————×100%
培养管总数
污染率应控制在2-5%，
质量控制-污染率过高？
可能原因
解决方法
标本保存不当 标本留取后尽快培养，暂时无法培 (时间、温度） 养应于40C冰箱保存不超过3天。
前处理不充分 材料灭菌不佳 操作不当 培养基因素
4％，1－2倍，充分混旋，20分钟。 接种用吸管需高压灭菌。 培训，严格按操作规程操作。 无菌试验，40C直立保存，1个月 内使用
质量控制
人员培训 • 仪器设备监控 • 培养基无菌试验、生长试验 • 每月对培养情况培养阳性率、涂阳培阴
率和污染率的统计分析
质量控制
• 1、涂阳培阴率：
培养阴性的病例总数 = ———————————×100%
涂片检查阳性的病例总数
涂阳培阴率应小于10%
注意：涂片、培养为同一份标本 数据统计为初治病人
核酸检测
• 焦磷酸测序法： 仪器昂贵 要求样本菌株纯度高-纯菌种
• PCR-反向点杂交法（基因芯片）: 仪器相对便宜 可对同一样本混合菌株同时鉴定 目前可鉴定的菌种17-24种
结核分枝杆菌药敏试验-菌种鉴定
临床数据
1. 2016年湖南省胸科医院分枝杆菌分离情况
方法
菌株数
MTBC
NTM
MGIT 960法
分枝杆菌的分类