utics
抗 体 制
药 第四章 抗体制药1
学习内容（一）
1、抗体制药概述 2、单克隆抗体制备的基本过程。 3、基因工程抗体。
第一节 概 述
♠1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素, 建立了血清疗法,开创了抗体制药。
♠ 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白 蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要 存在于γ球蛋白组分。
1、抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于 免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。 有的抗原可以用化学合成：地高辛 多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。
为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞 供体同一品系动物进行免疫。
目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小 鼠和 LOU大鼠，因此免疫动物也采用相应的品 系。
第二节 McAb及制备
一、 McAb
1、McAb定义
是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的针对一个 抗原决定簇的高度特异性和专一性的抗体。
2、McAb怎样产生？
是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤 细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤 细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。
二、McAb的制备
♠70年代中期，日本利根川进证实了Ig的基因结 构，获得1987年的the Nobel prize。
抗体？ 是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功 能的球蛋白。 抗体的产生？ 机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被 活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成 和分泌的球蛋白。
20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞 癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中 出现同抗体结构类似的球蛋白， 统称为免 疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig 是化学结构的概念，而抗体是生物学功能 的概念。
一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗 原，刺激B细胞分裂。
脾内免疫法即在麻醉下直接将0.1～0.2ml抗原 注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶 性抗原需10μg。
体外免疫法用于不能采用体内免疫的情 况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫 源性极弱，易引起免疫抑制。
优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因 素少。
软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞 分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态， 可用吸管吸出，移入96孔板培养。
4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定
杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。它是鉴 定的客观指标，了解分泌抗体的能力。 单抗进行Ig类和亚类鉴定： 用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行 免疫扩散或ELISA鉴定。 亲和力、特异性、纯度、分子量测定。
免疫方法
采用体内免疫法和体外免疫法。 体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较
多时应用，一般用8～12周龄雌性鼠。 颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原
性强，可不加佐剂，直接注入腹腔10个细胞进 行初次免疫，间隔1～3周，再追加免疫1～2次。
可溶性抗原按每只小鼠10～100 μg抗原与福氏 完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免 疫，间隔2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免 疫1～2次。
杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定—染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。 小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62~68，NS-1 为54~64，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝 点。
杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数 目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应 出现少数标志染色体。
3、筛选阳性克隆与克隆化
筛选阳性克隆常用检测方法： 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技 术等。 克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得 细胞集团的整个培养过程。
常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。
有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔 板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆 化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT 的RPMI 1640培养液。
多克隆抗体 polyclonal antibody
指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原 决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异 性抗体）。 实际意义： （1）预防、治疗感染性疾病，
如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风， 副作用：超敏反应
（2）临床诊断， 如：肥达氏反应 -- 伤寒、副伤寒 缺点：特异性差。
体外免疫法：用4～8周龄BALB/c小鼠的脾 脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其
浓度达0.5～5μg/ml,在5% CO237 C 下培养 4～5天,再分离脾细胞,进行细胞融合。
2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
细胞融合的方法 脾细胞（1×108） 骨髓瘤细胞（2～3×107）混合 聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用培 养液将融合液缓慢稀释。
抗原 免疫
传统抗血清 所有抗体混合
31 2 4
BA LB /c
1234
脾脏 淋巴結 B 细胞
31 2 4
单克隆抗体 monoclonal antibody，McAb
1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂 交瘤技术制备出单克隆抗体。 单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳 定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提 供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的 发展。
用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不 分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长 期稳定。 细胞融合后可产生多种融合 脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合细胞 如何去除脾-瘤以外的融和细胞？
选择性培养 －脾-瘤培养基为HAT培养液。 次黄 嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。 A阻断DNA合成。
P25
PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越 高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用 浓度为40%~50%，相对分子质量4000为佳。相对 分子质量在400~6000，浓度在10%~60%范围内 的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合率， 在PEG 溶液中加入DMSO，以提高细胞接触的紧 密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。