一、多糖的检测方法〔1〕粗多糖的苯酚-硫酸分光光度测定法〔2〕葡聚糖的分光光度测定法〔3〕硫酸软骨素的分光光度测定法二、皂甘类化合物的检测方法〔1〕总皂苷的分光光度测定法〔2〕绞股蓝皂苷的分光度测定法三、黄酮与甘类化合物的检测方法〔1〕总黄酮的风光光度测定法〔2〕原花青素的分光光度测定法〔3〕原花青素的铁盐催化比色测定法四、酶、激素与源性物质的检测方法〔1〕超氧化物歧化酶的氮蓝四唑测定法〔2〕超氧化物歧化酶的连苯三酚自氧化测定法〔3〕氯化高铁血红素的分光光度测定法五、其他类化合物的检测方法〔1〕总蒽醌的分光光度测定法〔2〕几丁胺糖的脱乙酰度滴定法〔3〕总三萜的分光光度测定法六、第一章概论（第3页）表1-1常见的保健食品的成效成分〔标志性成分〕、保健功能与主要来源〔第73页〕第三章保健食品中成效成分的检测方法第一节多糖的检测方法一、粗多糖的苯酚一硫酸分光光度测定法1、方法提要多糖经乙醇沉淀别离后，去除其他可溶性糖与杂质的干扰，再与苯酚一硫酸作用成橙红色化合物，其呈色度与溶液中的糖的浓度成正比，在485nm波长下比色定量。

4、测定步骤（1）样品提取：称取混合均匀的固体样品1.0〜2.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL 左右，与沸水浴中加热1小时〔如保健食品添加的已是多糖提取物，那么加热15min〕，冷却至室温后补加水至刻度线〔V1〕，混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀粗多糖。

在这里必须强调的是不少保健品添加了淀粉、糊精，一定要做相应的处理，否那么结果偏高。

添加淀粉的样品需加a-淀粉酶与糖化酶〔如葡萄糖昔酶〕处理。

添加糊精的样品需加糖化酶〔如葡萄糖昔酶〕处理。

处理的原那么是将这类非活性多糖的碳水化合物全部酶解成单糖或低聚糖，再用乙醇沉淀所需的活性多糖以达到别离的目的。

1）添加淀粉或淀粉+糊精的样品：可取50mL样品提取液置于100mL具塞锥形瓶中，冷却至60℃以下，加1mL10%淀粉酶液〔Singma公司的液状淀粉酶可直接加0.1〜0.2mL〕和0.5mL0.2M磷酸盐缓冲液，加塞，至55℃〜60℃酶解1小时，再加适量的糖化酶〔如葡萄糖昔酶〕〔约为样液体积的1%〕于60℃以下再水解60min后取出〔用电业检验是否水解完全，如不完全可延长水解时间至酶解液加碘液不变蓝色为止〕，于电炉上小心加热至沸〔灭酶〕，冷却，定容，过滤，取滤液沉淀粗多糖。

2）添加糊精的样品：如上法处理〔免加淀粉酶〕（2）沉淀粗多糖：准确吸取上滤液〔或液体样品〕5.0mL〔V2〕，置于50mL离心管中〔或2.0mL于15mL具塞离心管中〕，参加无水乙醇20mL〔或8mL〕，混匀，于4℃冰箱静置4小时以上，以4000r/min离心5min，弃去上清液，残渣用80%〔V/V〕乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次。

残渣用水溶解并定容至10〜25mL〔V3〕（根据浓度而定）。

（3）标准曲线的绘制：准确吸取葡萄糖标准使用液0mL、0.10mL、0.20mL、0.40mLL、0.60 mL、0.80mL、1.00mL〔相当于葡萄糖0mg、0.01mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg、0.10mg〕置于25mL比色管中，补加水至2.0mL参加5%苯酚溶液1.0mL, 在旋涡混合器上混匀，小心参加浓硫酸10mL,在旋涡混合器上小心混匀，至沸水浴中2min，冷却至室温，用分光光度计在485nm波长处以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。

以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

（4）样品测定：准确吸取上液适量〔V4〕〔含糖0.02〜0.08mg〕置于25mL比色管中，补加水至2.0mL,然后按〔3〕法测定吸光度值。

从标准曲线上查出葡萄糖含量，计算样品中粗多糖含量。

6、注释〔1〕本方法线性围在0.01〜0.1mg/mL，线性方程为y=0.3095x+0.0004，r=0.9989,假设工作需要标准曲线可延长至0.20mg/mL。

〔2〕本法测定样品中多糖时，提取时间以1小时为宜，以免因提取时间过长引起糖结构变化甚至使碳键断裂而导致所测多糖含量偏低。

〔3〕比色法测定多糖并非特异性反响，本法灵敏度高，出现测定结果平行性偏差较大，主要是操作不够严谨所致，反复几次的沉淀、洗涤、弃去上清液、样液的转移等都是造成测定结果偏差的原因。

实际操作时每个样品要多做几个平行样，并尽量取用几个近似值的均值报告结果。

由不同材料组成的保健品所形成乙醇沉淀物的结构也不同，用80%的乙醇洗涤沉淀物时〔如在15mL离心管中操作〕可先加少量〔0.5mL〕在旋涡混合器或超声波振荡器中以增大撞击与分散沉淀物的强度，尽量将沉淀物打散，然后再加数毫升80%乙醇洗涤，对于一些粘黏包裹状的沉淀物，也可先加少量水溶解，然后再加80%的浓度洗涤，力求将附在沉淀物的杂质除去。

〔4〕关于乙醇的浓度：由于保健食品组方的复杂性，不同分子量得多糖所用的乙醇浓度沉淀效果是不同的，通常使用80%乙醇浓度不一定完全使用于所有的保健品中粗多糖测定，最好能在75%、80%、85%、90%、95%的乙醇浓度之间做预实验以优选最正确的乙醇浓度。

〔5〕关于酶解1〕淀粉酶的水解具有专一性，她只水解淀粉而不会水解其他多糖，在淀粉酶的作用下，使淀粉水解成低分子糊精和麦芽糖，再在糖化酶〔如葡萄糖昔酶〕的作用下变成葡萄糖。

酶的用量应根据酶的活力而定。

2〕糖化酶是几种酶的简称〔学名a-1,4-葡萄糖水解酶〕，包括葡萄糖甘酶、淀粉葡萄糖甘酶〔简称为葡萄糖昔酶〕、普鲁兰酶。

药用辅料的淀粉一般都是直链淀粉，用a-淀粉酶+葡萄糖昔酶〔作用于直链淀粉，1,4糖昔键〕处理就可，如要作用于支链淀粉，需同时参加普鲁兰酶〔作用于1,6-糖昔键〕才能完全变为葡萄糖。

3〕酶的活性对酶解的效果影响较大〔6〕多糖一复原糖换算系数0.9之解释〔7〕粗多糖测定最终报告结果要标示以葡萄糖计或葡聚糖计，因两者测定值相差很大。

〔第82页〕四、葡聚糖的分光光度测定法本方法适用于各类食品中以葡聚糖为主要结构、相对分子质量1*104以上的水溶性粗多糖的测定。

本方法的最低检出浓度为5.0mg/L。

1、方法提要食品中相对分子质量大于1*104的高分子物质在80%乙醇溶液中沉淀，与水溶液中单糖和低聚糖别离，用碱性二价铜试剂选择性地从其他高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多糖，用苯酚一硫酸反响以碳水化合物形式比色测定其含量，其显色强度与粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此计算食品中粗多糖的含量。

4、测定步骤〔1〕样品处理1〕样品提取：称取混合均匀的固体样品2.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL左右，与沸水浴中加热2小时，冷却至室温后补加水至刻度线，混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀多糖。

2〕沉淀粗多糖：准确吸取1〕项终滤液5.0mL或液体样品5.0mL，置于50mL离心管中，参加无水乙醇20mL,混匀5min后，以3000r/min离心5min，弃去上清液，残渣用80%〔体积分数〕乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3〜4次。

残渣用水溶解并定容至5.0mL，混匀后供沉淀葡聚糖。

3〕沉淀葡聚糖：准确吸取2〕项终溶液2mL，置于20mL离心管中，参加100g/L氢氧化钠溶液2.0mL、铜试剂溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷却，以3000r/min离心5min，弃去上清。

残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次，残渣用10%〔体积分数〕硫酸溶液2.0mL溶解并移至50mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，混匀。

（5）标准曲线的绘制：准确吸取葡聚糖标准使用液0mL、0.10mL、0.20mL、0.40mLL、0.60 mL、0.80mL、1.00mL〔相当于葡聚糖0mg、0.01mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg、0.10mg〕置于25mL比色管中，准确补加水至2.0mL,参加50g/L苯酚溶液1.0mL,在旋涡混合器上混匀，小心参加浓硫酸10.0mL在旋涡混合器上小心混匀，至沸水浴中2min，冷却至室温，用分光光度计在485nm波长处以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。

以葡聚糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

（6）样品测定：准确吸取样品测定液2.0mL，置于25mL比色管中，参加50g/L苯酚溶液1.0mL,在旋涡混合器上混匀，小心参加浓硫酸10.0mL,在旋涡混合器上小心混匀，至沸水浴中2min，冷却至室温，用分光光度计在485nm波长处以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。

从标准曲线上查出葡聚糖含量，计算样品中粗多糖含量。

同时做样品空白试验。

6、准确度与精细度在不同食品中进展不同浓度的加标回收试验，回收率为87.8%〜110.87%，不同实验室对同一样品进展10此测定结果的相对标准偏差为5.8%。

7、注释本方法测定的水溶性多糖含有10个以上单糖残基。

经过五个检测单位的验证，本方法所测定的结果一葡聚糖计。

（3）干扰因素试验证明，在样品中参加与粗多糖灯亮的乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖与2倍量得淀粉、糊精，不影响样品中粗多糖的测定结果。

但在测定过程中应防止糖和其他碳水化合物的污染，因为苯酚一硫酸与糖和碳水化合物起反响。

（7）某些保健食品中成效成分为醇溶性多糖，可参照本方法进展测定，但样品预处理时将乙醇改为丙酮即可。

（8）液体样品中粗多糖含量低时，可取样50.0mL加热浓缩至5.0mL后，再依法操作测定。

（8）洗涤粗多糖沉淀时，一定要将离心管壁上玷污的其他糖分和碳水化合物用80%乙醇洗净，否那么结果偏高。

8、关于保健食品粗多糖测定方法分光光度法的说明多糖因单体组成、结构、聚合度、物化性质等各异，故测定方法不同，此法适用于测定高分子量的糖类物质〔＞10000Da〕多糖的定义是聚合度大于9的糖〔第110页〕十一、硫酸软骨素的分光光度测定法本方法硫酸软骨素的检出限为0,01mg/L。

1、方法提要结晶紫是一种阳离子染料，在酸性条件下带正电荷，易与带酸性基团的生物大分子发生静电作用而形成离子配合物，已用于脱氧核糖核酸、干扰素等的分光光度法分析。

结晶紫结构中的氨基带正电荷，硫酸软骨素的磺酸基和竣基带负电荷，两者通过静电引力和输水作用力形成络合物，产生变色效应，吸光度降低。

吸光度的降低量与硫酸软骨素含量线性相关。

4、测定步骤〔1〕样品处理：精细称取容物25mg，置于100mL量瓶中，加水适量，超声处理10min，加水定容至100mL，过滤，取续滤液4mL,置于100mL量瓶中，加水至刻度，得样品溶液。

〔2〕分光光度法测定：取供试品溶液1mL，置于10mL具塞刻度试管中，参加pH5.0的醋酸一醋酸钠缓冲液1.0mL和结晶紫并粗三溶液0.6mL，加水至10.0mL，摇匀，30℃水浴保温20min,放至室温。