液相原位杂交示意图 • Dots hybridization 点状杂交 待测核酸为DNA 或RNA • Colony or plaque hybridization, 菌落或噬菌班杂交 待测核酸为DNA • Tissue hybridization 组织原位杂交 检测mRNA表达 和定位 研究基因的定位,拷贝数,测序
z
1952年 Hershey和 Chase 噬菌体感染实验
RNA也可以作为遗传物质 TMV重建实验 RNA不如DNA稳定 是否存在核酸以外的遗传物质
DNA作为遗传信息的原因:
1. 信息量大,分子量大 2. 双螺旋结构,能自我复制 3. 2’脱氧,稳定性好 4. 易突变 5. 有T,无U 基因: 编码一条有功能的多肽链或RNA所需的DNA序列
因此 同 样是12pg的DNA 细菌为3000 而真核 为4 相差750倍 细菌基因组的复性速 度比真核基因组的复性速度大750倍 或 者说真核基因组的C0 t1/2 值是细菌的 750倍
C0 t 值的意义 C0 t1/2 值可以用来表示反应体系中DNA的总长度 单拷贝 这种总长度称为DNA的复杂性 通过测定复性动力学可以预 测基因组的大小 动力学复杂性 待测DNA复杂性(bp) C0 t1/2 (待测DNA = 4X106 bp C0 t1/2 (已知DNA)
第四节 DNA的变性复性和分子杂交
一. 变性(溶解) 在某些物理化学因子的作用下 DNA双链间的氢键断裂 双链解离形成单链
(一) 性质变化 增色效应 黏度降低 沉降速度增加 (二) 因素 1 温度 温度升高
引起的DNA变性称热 变性 加热使氢键断裂 可用热变性曲线描述热变性过程
融点 Tm 50%DNA分子解链时的温度 融点与DNA分子中的GC有关 随 G+C 呈线性增加 %的含量
化学因素 甲酰胺 破坏氢键
二. 复性 去除变性条件后 单链DNA在适当条件下重新形成双链 回复到原有的物理和生物学特性
(一) 复性动力学 复性过程是两条单链DNA碰撞形成双链DNA的过程 是双 分子反应 服从二级反应动力学规律
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控制复性反应的两个 参数是C0 和t 复性反应进行到50%时 的C0 .t 为C0 t1/2 浙大P11
Z-型构象的主要特征
• 糖-磷酸主链的走向呈之字形, 分子呈左手螺旋构象每一螺圈 含12对碱基, 距离为4.46nm • 糖环折叠不同于A或B型DNA, 鸟嘌呤碱基绕糖苷键旋转呈 顺式构型,而嘧啶碱基仍是反式构型, 前者的糖环折叠是C3-endo, 后者是C2-endo.
Z-DNA仅有一条小沟, 且较深, 含有较高的负电荷密度. Z-DNA较B-DNA细而“舒展”, 螺旋直径为1.8nm,
•举例说明 •C0为12pg的DNA •如果是细菌的DNA 细菌的基因组为 4X10-6bp,相当于0.004pg 12pgDNA中 每一种顺序有3000个拷贝 •如果是真核基因组 大小为4X10-9bp, 相当于3pg, 12pgDNA中每一种顺序(假 定为单拷贝 有4个拷贝.
z C0按相同顺序的拷贝数计算
DNA 分子中有 T 无 U
AGGTCGCAGC 脱氨基 AGGTCGUAGC 修复 AGGTCGCAGC AGGUCGCAGC 脱氨基 AGGUCGUAGC 不能辨别 AGGCCG烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 证实RNA也是重要的遗传物质 Tobacco mosaic virus,TMV 5%RNA, 95%Protein
二. DNA的二级结构
DNA的二级结构就是双螺旋结构 受环境因素, 如平衡离子类型 离子强度, 特异结合蛋白 水合
状态等的影响, 以及DNA分子碱基的组成都可促使DNA分子取 不同的构象. DNA分子存在多种构象----二级结构的动态结构 (一) B型结构 右手双螺旋 B-型结构也称右手双螺旋结构 53年由Watson 和Crick首先提出 这是水溶液 或相对湿度92%以上 中的主要构象
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第二节 DNA结构
一. DNA的一级结构
第二节 DNA结构
定义
一. DNA的一级结构
核苷酸排列顺序 或称碱基排列顺序
5’-ATCGGCTAAGGCTCCGACGA--3’ 3’-TAGCCGATTCCGA GGCTGCT--5’
人类基因组计划 –20世纪生物学最宏伟计划 人类基因组的作图与测序 人类基因组计划 计划耗资30亿美圆 人类基因组有30亿碱基对的测序 1990-2005
负超螺旋 形成1个超螺旋 W=-1 正超螺旋 形成1个超螺旋 W=+1
拓扑异构体: Topological isomers 具有完全相同的碱基顺序,但 L值不同的超螺旋. 拓扑异构体的互变由拓扑异构酶催化 的断开和连接 两种拓扑异构酶 分为I, II型 Topoisomerase I机理 切一条链 不需能量 Topoisomerase II机理 切两条链 需能量 溴乙锭作用:形成正超 可作用于正超 SV40DNA 负 松弛 正 C型酶 对正超无作用 发生一条链或两条链
Chargaff.E告诉我们什么
z 当量定律
A G=T+C z DNA碱基组成具有物种特异性 无组织特异性
而
DNA双螺旋的发现
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1938年 W.T.Astbury和Bell用X衍射研究DNA Hammorsten Caspersson提供 1947年第一张 DNA衍射照片
1950年Chargaff的当量规律 z 1951年Pauling和Corey连载7篇α 螺旋结构文章 z 1952年R. Franklin和Wilkins 一张清晰的DNA结晶X衍射照片
探针: 一种标记的一段DNA或RNA 与待测基因序列的 DNA或RNA互补 Southern DNA 印迹转移技术: 在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上 然 后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转 移的DNA片段 这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术 E.Southern于1975年设计
三. 分子杂交 原理 基于DNA的变性与复性的特性 双链DNA加热以后 变成单链 在去除变性条件后 在一定的条件下 具有互 补顺序的DNA能再形成双链
核酸分子杂交技术: 1968年由华盛顿卡内基学院 Cavnegie Institute of Washington 的Roy Britten及其同事发明的 原理是:当带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或 RNA混合在一起时 其相应的同源区段将会退火形成 双链的结构
四 真核基因组DNA的复性动力学
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C0 t 值的范围常跨越8个数量级
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动力学曲线出现多个拐点
真核基因组DNA的复性动力学 • 第1是 快复性动力学组分 高度重复序列 • 第2是 中复性动力学组分 中度重复序列 • 第3是 慢复性动力学组分 单拷贝序列
x: DNA的复杂性 Cot 曲线特征 曲线意义: 求DNA的复杂度 化学复杂性
1956年 Gierer和Schraim 分离RNA和protein的实验
RNA杂合病毒实验
1957年 Heinz Fraenkel-Conrat和B. Singre 的杂合病毒实验 HR(Holmes Rib Grass Strain) M(Masked Strain) TMV
Levene 的四核苷酸假说
影响因素 DNA构象家族 三种构象特征的比较
(四) 沟信息的识别 大沟和小沟的信息区别
氢键 O , N, 受体a, NH2 供体d 大沟(a-d-a) A-T 小沟(a-a) 小沟( a-a-d,d-a-a) G-C 小沟(a-d-a)
(五) DNA二级结构的其他构象 1) 回文序列 反向重复中的序列 5GGTACC 3 3CCATGG5 十字型---反向重复序列不一定完全相同 生物学功能 限内酶位点 RNA转录的终止 tRNA环
Topoisomerase I
Topoisomerase II
溴乙锭作用:
第三节 DNA双螺旋的呼吸作用
甲醛的变性实验
甲醛的变性实验 甲醛只能与DNA上自由的氨基起 作用 键处于动态平衡 呼吸作用的定义 氢键的迅速形成和再生 碱基对的稳定性 浙大P5 碱基对的组成和排列顺序 影响 从嘌呤到密啶方向碱基堆积力强 生物学作用 A-T富含区往往是复制 转录的起始 区
捣碎
体内转化实验
DNA是遗传物质的证明
1928年
英国微生物学家Griffith.F做了肺炎双球菌的转化实验
体外转化实验
DNA是遗传物质的证明
1944年 Avery.O Macleod.C 揭开了转化因子的化学本质
McCarty.M.J
噬菌体的侵染标记实验
DNA是遗传物质的证明
1952年Hersey和Chase的同位素标记侵染实验
2) DNA的四链结构 鸟嘌呤四联体 非正常的G-G氢键 糖苷键为反式构想 平行排列
生物体中可能存在G四联体 的依据 端粒 酵母抽提液
3) 三螺旋DNA 存在条件:一条全嘌呤,另一条全嘧啶. 特征: 两条全嘧啶链和一条全嘌呤链组成三 螺旋结构 氢键为Hoogsten氢键 第三条链位于正常双螺旋的大沟中 H-DNA
三 . DNA的三级结构—超螺旋结构
形成条件 cccDNA 63年发现
类型
正超
负超
松弛型 性质的变化 沉降系数 电泳迁移率 生物学意义 包装 解链
拓扑性质
带子模型 Linking number)表示超螺旋的的拓扑性质
通常以链环数
是指一个环状封闭双螺旋DNA分子两条链彼此交叉的次数 L = W+T T 代表双螺旋中的罗圈数 数量=总碱基数/每一罗圈的碱基数 松弛分子的W 值等于零 举例 一个200bp的环状闭合双链DNA W=0 L= W+T = 0+ 200bp/10 bp L=W+T = -1+ 200bp/10 bp=19 L=W+T = 1+ 200bp/10 bp=21 松弛型 没有超螺旋 W 超螺旋的程度 双螺旋中心轴盘绕的圈数