变性
95˚C
延伸 70-75˚C
退火
Tm-5˚C
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P1 第 一 次 循 环
94℃ 72℃
Taq DNApol.
P2
（35-65℃）
94℃
第 二 次 循 环
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PCR技术最关键的两步
• 引物的设计 引物必须相应于模板分子相邻的序列，引 物序列于对应的模板连应该是互补而不是 相同的，这样杂交才会发生且杂交后的引 物的3‘末端应该对着另一条引物的3’末 端。最重要的是引物的长度，因为引物的 长度影响其杂交到模板DNA上去的效率，引 物越长杂交所需的时间越长；引物太短可 能与目标位点以外的位点相杂交，而扩增 出我们并不需要的产物
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噬菌体载体
λ噬菌体 一种典型的头-尾结构，双链线状DNA分子，全长50kb，含66个基 因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末 端，被称为COS位点
M13噬菌体
一种典型的纤维状结构，其DNA分子相比λ噬菌体要小的多，长度 仅6407个核苷酸，通常为环状双链DNA
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λ噬菌体结构
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2019/9/19
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• 退火温度 温度太高，不会有杂交发生引物与模板仍 然相互分离；温度太低，又会有稳定的错 误配对发生。退火温度有引物-模板杂交结 构的解链温度(Tm)决定，Tm是指正确的碱 基配对杂交结构相互分开的温度 Tm={(4*[G+C])+(2*[A+T])}˚C
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DNA操作酶
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重组DNA导入宿主细胞的类型
转化：以质粒作载体构建的重组体 导入受体细胞的过程
类 转染：以病毒作载体构建的重组体 型 导入受体细胞的过程
转导：以噬菌体作载体构建的重组 体导入受体细胞的过程
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• 感受态细胞 受 体 细 胞 经 过 一 些 特 殊 方 法 （ 如 CaCl 、 RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的 通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的细胞
dNTP为原料，按碱基配对方式，从 杂交链中的RNA ⑶ 以DNA为模板，
5’-3’ 方 向 合 成 新 的 DNA 链 。 催化合成cDNA双链
TaqDNA聚合酶在70～75℃时具有最
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佳的生物活性
DNA重组技术
分—获取目的基因和载体 接—目的基因与载体的连接 转—重组DNA导入宿主细胞 筛—重组DNA的筛选与鉴定
4
有时还要求载体要能启动外源 基因进行转录及表达，并且尽 可能是高效的表达
载体的特性
5
从安全角度考虑，要求载体不 能随便转移，仅限于在某些实 验室内特殊菌种内才可复制
6 有适合的标记，易于选择
5
克隆载体
1 质粒载体 2 噬菌体载体 3 酵母菌质粒载体 4 动植物病毒载体
6
质粒载体
• 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一 般大小约为数千碱基对，可自身复制和表达，有 的质粒还带有可做 为选择性标记的抗 药性基因，所以质 粒经过适当改选后 便可成为良好的载 体
分子克隆
报告人：
LOGO
1
C
o
克隆载体
n
t
PCR技术
e
n
DNA操作酶 LOGO
t
s
DNA重组技术
2
分子克隆
• 分子克隆（基因克隆、DNA重组技术） 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、 连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩 增形成大量子代分子的过程。分子克隆的 核心是：体外重组即人工将一段目的DNA插 入一个载体的过程
A 限制性内切酶
是一类由细菌产生的能专一识别和 切割双链DNA中的特定碱基序列的 核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据限制酶作用特性，一般分为Ⅰ、 Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制 酶
B T4DNA连接酶
催化双链DNA中一条链的3ˊ－OH与 另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二 酯键，从而构成完整的DNA长链
• 它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有 一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬 菌体的DNA注入细菌内
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cos位点的作用
• cos位点在λ噬菌体侵染周期中起着两种截 然不同的作用
使已经注入细胞的线性DNA分子闭合成环，这是使噬菌体 DNA分子插入细菌基因组的必要先决条件
当前噬菌体被从宿主细胞中切除后，此时其作为一个限制性 内切核酸酶的识别序列
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λ噬菌体的侵染模式
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M13噬菌体的侵染过程
• M13以纤毛吸附大肠杆菌，并向其注入自身DNA
单链DNA注入宿主细胞后，合成第二条链(双链复 制模式 RF)
RFDNA拷贝数达到100～200个后 ,通过滚环复制机 制产生线状单链DNA
包装成为成熟的噬菌体颗粒并从细菌体内溢出
。
12
PCR的基本反应步骤
3
分子克隆的路线
载体DNA （vector）
重组DNA （recombinant DNA ）
目的DNA DNA 重组
（target fragment）
转化
宿主（host）
筛选、扩增
克隆（clone）
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载体的特性
1
分子较小，可携带比较大的DNA片段
2
能独立于染色体而进行自主 复制并且是高效的复制
3 要有尽可能多种限制酶的切 割位点，但每一种限制酶又 要最少的切割位点
C TaqDNA聚合酶
D 逆转录酶
TaqDNA聚合酶是一种依赖DNA的单 逆转录酶是一个多功能性酶，至少
亚基耐热DNA聚合酶， 主要用于聚 具 有以下 3种酶 活性： ⑴ 以单 链
合酶链式反应中，能以DNA为模板， RNA为模板，催化合成cDNA单链 ⑵
从 结 合 在 模 板 上 的 引 物 出 发 ， 以 具有 RNaseH活性 ，能水解 RNA:DNA
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目的基因的来源
Con 制备基因组DNA ten ts
聚合酶链反应
目的基因 来源
Con 制备cDNA ten ts
人工合成基因

.
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目的基因与载体的连接
粘性 末端 连接
平头 末端 连接
人工 接头
法
同源多 聚尾连 接法
将目的基因和 载体用同一种 限制酶酶切， 产生相同粘性 末端，再通过 DNA连接酶作 用将两者连接 起来，构成重 组DNA分子
有些限制酶 只能将目的 基因和载体 DNA切割成平 端，此时在 T4DNA连接 酶的作用下 同样能连起 来。
合成连接子 →与DNA平 头末端连接 →限制酶切 割,产生粘 性末端→连 接，构建重 组DNA。
2019/9/19
可编辑
要求DNA分子内 部必须完整， 即两个DNA链间 不存在缺口； 否则末端脱氧 核苷酸转移酶 也会在3’-OH 上加入多聚尾 巴，破坏了DNA 分子活性