三、实训材料及器具(每组)
材料：乳糖胆盐发酵培养基，乳糖发酵培养基，伊红美蓝琼脂培养基,革兰氏染色试剂，液体石蜡，黄酒等
器具：显微镜1台，酒精灯1只，接种环1根，载波片2-3片，大试管23支，短杜氏小管18支，刻度吸管1ml 8支，10ml 1支，25ml 1支，500锥形瓶1个，250锥形瓶1个，培养皿10套，300ml烧杯1个，玻璃棒1支。
用卢戈氏碘液媒染约lmin，水洗。
（6）脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管连续滴加95%的乙醇通过涂面脱色20～30s，至玻片下端流出的乙醇无色时，立即水洗，将载玻片上的积水甩干。革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是操作的关键环节。
（7）复染
在涂片上滴加番红液复染约2～3min，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。
3．分离培养(第二天下午)
将产气管接种伊红美蓝琼脂培养基36±1℃培养18-24小时。然后观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实实验。
大肠菌群可疑菌落的特点是：
①．深紫黑色，具有金属光泽的茵落；
②．紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；
③．淡紫黑色，中心色较深的菌落。
4．证实实验：(第四天下午)
在上述平板上，挑取可疑大肠菌落1-2个进行革兰氏染色。镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌时，挑取该菌落片的—部分，接种乳糖复发酵管，置(36±1)℃恒温箱内，培养(24±2)h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产酸产气，证实有大肠菌群存在，即可报告为大肠菌群阳性。
（三）仪器包扎：（每组用量）(第一天上午)
培养皿6套，刻度吸管1ml 6支，25ml 1支，灭菌备用。
（四）测定
1．样品稀释处理：(第一天下午)
用25ml灭菌吸管吸取25ml黄酒，加入225ml灭菌生理盐水制成1：10稀释液。再用1ml灭菌吸管取制备好的1：10稀释液1ml，加入9ml灭菌盐水制成1：100稀释液，依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支1ml灭菌吸管。
2．乳糖发酵试验：(第一天下午)
根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度(10-1、10-2、10-3)，接种乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种三管。每管接种量1ml（乳糖胆盐发酵管10ml+1ml稀释液）置36±1℃培养24±2小时，如果所有发酵管都不产气，记录大肠菌群阴性，如有产气按下列程序进行。
2.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
主要有两点：A、革兰染色G+菌培养12～18h为宜,菌龄太老，因菌体死亡或自溶常使阳性菌呈阴性反应。B、革兰染色要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精脱色，时间过短，G-可染成紫色造成假阳性；反之，G+也可染成红色造成假阴性。
其中最关键的环节是酒精脱色的时间要控制好
25ml黄酒
各管1ml
35-37℃
培养24±2h
[板书]五、实验结果与分析（报告）(第五天下午)
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
实验报告记录模板
检品名称：批号：规格：
检验日期：报告日期：
凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌可报告大肠菌群阳性。
（2）干燥
涂片最好在室温下自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方利用热气烘干,也可用吹风机吹干。
（3）固定
让菌膜面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外焰来回通过三次，即为固定。
（4）初染
滴加草酸铵结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于涂面上，染色50s，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上的积水甩干。
（5）媒染
一、检验程序
二、检验镜检结果记录及报告
1、乳糖发酵试验
阳性管数
10-1×3
10-2×3
10-3×3
2、革兰氏染色
项目
菌落1
菌落2
菌落3
形状
颜色
结果判断
3、MPN结果报告
检验项目
单位
标准值
实测值
判定
大肠菌群MPN
MPN/100ml
注
意
事
项
1.整个检验过程要注意无菌操作。
2.注意及时记录实验结果和现象。
a)用25ml吸量管吸取25ml黄酒（考试用水样）放到装有225ml的生理盐水的锥瓶中混匀，制成10-1的稀释级；
b)用1ml灭菌吸管吸取10-1稀释液1ml，沿管臂慢慢注入含有9ml的生理盐水的试管里，振摇混匀即得10-2的稀释级，注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管；
c)选择三个稀释度(10-1、10-2、10-3)，接种乳糖胆盐发酵管（考试时是水），每个稀释度接种三管。每管接种量1ml（乳糖胆盐发酵管10ml+1ml稀释液）；
2.革兰染色镜检：
从老师已经培养好的EMB平板培养物中挑取2-3个菌落进行镜检（做2-3张片）
革兰氏染色法：涂片→干燥→固定→结晶紫初染（50s）→水洗→卢戈碘液媒染(1min)→水洗→95%乙醇脱色(20-30s)→水洗→番红复染(2-3min)→水洗→干燥→镜检(油镜观察)。在油镜头下观察到的结果要让考官看并打分。
接种量
管号
发酵反应结果
有无典型菌落
革兰染色结果
复发酵反应结果
阳性管数统计
1
1
2
3
2
1
2
3
3
1
2
3
根据证实实验结果，查MPN表，结果报告<每100ml（g）>大肠菌群最可能数
注：+表示阳性；-表示阴性
[板书]六、检验工考证简解(第一天上午或第四天上午)
1.准备、检测
注：实验前要注意填写好考官给的评分表，接着开始做实验前要先消毒手和桌面，用消毒棉球。（注意考试做到10-2稀释级）
3.结果报告：（用表格来填写）
根据老师提供的已培养好的乳糖胆盐发酵管的情况进行记录，报告。
凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌可报告大肠菌群阳性。
4.评分标准
考核要素
评分要素
配分
评分标准
取样量
9管3个浓度的选取稀释与样品中和
8分
浓度稀释与中和正确（7-8分）
稀释基本正确（4-6分）
不正确（3分以下）
6分
结果正确、报告清楚（5-6分）
结果不正确（4分以下）
5.注意事项：大家可以看检验标准，要熟悉整个检验程序，记住操作步骤，注意无菌操作的要求，熟悉吸量管的使用，注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管。
6.考核结束后
每个同学要把用过的器具洗干净（平板培养物不能洗），同时在大锥瓶装约225ml自来水放回原位；桌面收拾干净。
2人一组
实验实训中心签字
实训目的
1．了解黄酒中大肠菌群的测定原理。
2．学习并掌握黄酒中大肠菌群的检测方法。
3．巩固微生物接种与分离技术，细菌染色技术。
教学内容与要求
1．培养基的配制及实验材料准备。
2．供试液的制备。
3．发酵管的接种。
4．分离培养。
5．染色试验等
重点难点
1．供试液的稀配。
2．大肠菌群计数方法。
[板书]七、单项技能操作训练(第一天上午或第四天上午)
学生根据的实际情况自由练习显微镜的使用、革兰染色、样品稀释。
考试实验结果记录表
学校（单位）：姓名：准考证号：
食品（黄酒）中大肠菌群测定
检品名称：批号：规格：
检验日期：报告日期：
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
[板书]四、实训步骤及操作讲解
（一）稀释液配制：（每组用量）(第一天上午)
称取氯化钠2.7克蒸馏水300ml
配制生理盐水300ml，分装到500ml锥形瓶一个，内装量225ml，大试管3支（9ml），加塞包扎，灭菌,备用。
（二）培养基的配制（每2组用量）(第一天上午)
1．制备乳糖胆盐培养基(200ml)：取乳糖胆盐培养基6克，加入蒸馏水200ml搅拌加热煮沸至完全溶解，分装18支大试管，10ml/支，每支并加入一支倒置的杜氏小管，加塞包扎，灭菌备用。
广东食品药品职业学院教学教案
（2012～2013学年第二学期）
课程名称
食品检验员职业资格考证
实训项目
黄酒中大肠菌群测定
检验工考证简解、单项技能训练
课时
16
教学对象
11食品检测
授课日期
2013.05
教材
GB/T 4789.3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定
教师姓名
陈琼
教学方法
演示法、练习法
实验形式
仪器
天平、称量纸、药匙、精密pH试纸、量筒、试管、锥瓶、玻璃棒、烧杯、10ml、1ml吸量管、试管架、棉花、线绳、报纸、灭菌锅等、擦镜纸、吸水纸等。
试
剂
乳糖胆盐培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰培养基、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液、蒸馏水、革兰氏染色试剂、香柏油、二甲苯。
菌种：大肠杆菌斜面培养物
涂片染色流程：挑取可疑菌落涂片→干燥→固定→初染（草酸铵结晶紫、50s）→水洗→媒染（卢戈氏碘液、lmin）→水洗→脱色（95%的乙醇、20～30s）→水洗→复染（番红液2min）→水洗→晾干→镜检。
（1）涂片
取洁净无油的载玻片，将接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后,用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上，并涂抹成直径1.5cm左右的菌膜
课后记
3.革兰染色要严格控制各试剂的作用时间，尤其是酒精脱色，时间过短，G-可染成紫色造成假阳性；反之，G+也可染成红色造成假阴性。染色过程勿使染料干凅。水洗时，水流不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落，一般以冲洗下来的水基本无色为度。