实验一培养基的制备与灭菌
一、实验目的
1. 了解配制培养基的一般方法和步骤;掌握牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖(蔗糖)培养基的制备方法。

2. 了解灭菌的原理，掌握高压蒸气灭菌的操作方法。

二、实验器材
1. 药品:牛肉膏;蛋白胨;氯化钠;葡萄糖(蔗糖);琼脂;1N NaOH;1N HCl等。

2. 仪器及其他:试管;锥形瓶;量杯;玻璃棒;漏斗;纱布;棉花;报纸;天平或台秤;马铃薯;电炉;铝锅;灭菌锅等。

三、实验方法
(一)配制培养基的基本过程:
(1)称量:按照培养基配方，称取各种原料放于锅中;
(2)溶解:锅中加入所需水量(自来水)，加热溶解。

要不断搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补足失去的水分;
(3)调pH值:按配方要求调节;
(4)过滤:用过滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求，此步可以省去。

(5)分装:按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。

分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。

分装量:斜面培养基装入的培养基约为试管高度的l/5,1/4，灭菌后制成斜
面。

分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。

(6)加棉塞:试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。

制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。

也可借用玻璃棒塞入，也可以用折叠卷塞法制作棉塞(见图)。

棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。

棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，以瓶、管不下落为准。

棉塞的2/3应在管内，上端露出1/3，便于提拔。

如制作时不慎沾上培养基则不可再用。

(7)包扎:加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。

若培养基分装于试管中，则应以7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。

然后用笔注明培养基名称、组别、日期。

(8)灭菌:将上述培养基于121.3?湿热灭菌30min。

(9)摆斜面:灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。

(10)无菌检查:将灭菌的培养基放入37?温箱中培养24,48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。

(二)灭菌方法采用高压蒸气灭菌法灭菌，步骤如下:
(1)打开锅盖，内层锅装入待灭菌物品。

注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。

三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

(2)加适量水。

(3)加盖，旋紧螺栓，勿使漏气。

(4)加热，并同时打开上排气阀，水沸腾排气后打开下放气阀，以除锅内的冷空。

让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。

当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

本实验用121.5?，30min灭菌。

灭菌的主要因素是温度而不是压力。

因此锅内冷空气必须完全排尽。

(5)灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。

否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。

(6)取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37?温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。

(三)培养基配方:
1. 肉膏蛋白胨培养基(用于培养细菌)
牛肉膏 5g; 蛋白胨 10g; 氯化钠 5g; 琼脂 15,20g;水 1000mL; pH 7.2,7.4 牛肉膏可放在载玻片上称量，放锅中溶解后取出玻片。

可免过滤步骤。

2、马铃薯葡萄糖培养基(用于培养真菌)
马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15,20克，1000 mL自来水;pH自然。

制法:将马铃薯去皮，并切成薄片，每加，煮沸30分钟，用纱布过滤，滤液放入干净锅中，加入琼脂和糖溶化后待分装。

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四、注意事项
1、准确称量;
2、注意搅拌;
3、分装前补足水量;
4、分装时不使培养基沾到管口(瓶口);
5、灭菌时要排净冷气。

图棉塞的制作过程
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