实训六 培养基的制备与灭菌
一、实训目标
知道培养基的用途，能根据不同微生物和不同培养目的选择培养基类型。

学会常用培养基的配制、分装、无菌操作方法。

了解高压蒸汽灭菌和干热灭菌的基本原理及应用范围，学会高压蒸汽灭菌和干热灭菌的操作步骤与方法。

二、实训材料用具
1．材料与药品：马铃薯、蔗糖（葡萄糖）、琼脂、可溶性淀粉、牛肉膏、蛋白胨、1 mol/L NaOH 、 1 mol/L HCl 、K2HPO4、KNO3、MgSO4•7 H2O 、FeSO4•7 H2O 等。

2．仪器与用具：灭菌室、超净工作台或接种箱、恒温箱、烘箱或红外线干燥箱、紫外线灭菌灯、电炉、铝锅、天平、烧杯、量筒、培养皿、高压灭菌锅、pH 试纸(5.5～9.0)、试管、三角瓶、铁丝试管筐、试管架、漏斗及漏斗架、玻璃棒、纱布、棉花、牛皮纸、绳、记号笔等。

三、实训步骤与要求
（一）配制培养基
1.配方
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA ）主要用于植物病原菌物的分离和培养，有时也用于植物病原细菌；牛肉膏蛋白胨培养基（NA ）主要用于细菌的分离和培养。

2.配制流程
（1）称量原料 按配方比例准确称量各种原料，马铃薯称重前需洗净去皮。

（2）溶化原料 制备PDA 培养基的马铃薯要切成小块，加水煮沸约0.5 h 后，用纱布滤去马铃薯残渣，在马铃薯滤液中加入琼脂，继续加热使琼脂完全溶化。

注意溶化琼脂过程中要控制火力的大小并不断搅拌，以免溢出或烧焦；待琼脂完全溶化后应补充加热过程中蒸发的水分，以保持溶液的浓度。

牛肉膏蛋白胨培养基先将琼脂加水煮至溶化后，再将其他原料溶于水中。

（3）调节pH PDA 培养基略带酸性，培养菌物一般不需调节pH 。

培养细菌一般需调节pH 至
7.2～7.4，可用l mol ／L NaOH 或 1 mol ／L HCl 溶液进行调节。

调节时应逐滴加入NaOH 或HCI 溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。

（4）过滤分装趁热用四层纱布过滤培养基，分装至三角瓶时以瓶高的1/3较为合适，分装至试管时培养基的高度不应超过试管高度的1/5。

一般试管做斜面培养基的约装5 mL，注意培养基不可沾污三角瓶口和试管口。

（5）加棉塞分装完毕后，用棉塞堵住管口或瓶口。

（6）包扎加塞后，将试管约每10支1捆扎好，在棉塞部分外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。

（7）标记在牛皮纸上用铅笔或玻璃铅笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等。

（二）灭菌
1.灭菌前的准备工作
玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。

平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。

2.高压蒸汽灭菌
手提式高压蒸汽灭菌锅操作方法和注意事项如下：
（1）加水打开灭菌锅盖，取出内层灭菌桶，向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

（2）装料放回内层灭菌桶，装入待灭菌物品。

注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。

（3）加盖关闭灭菌器盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。

再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

（4）加热、排气与升压用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀。

待水沸腾后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5 min，使锅内冷空气完全排净，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。

（5）保压和降压当锅内压力上升至所需指标时，开始计时，并维持所需压力。

一般用0.1 Mpa l21.5 ℃，试管内培养基灭菌20 min，三角瓶内培养基灭菌30 min。

待时间达到灭菌所需时间后停止加热，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子取出灭菌物品。

如果压力未降到0时打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。

（6）检定保存培养基经灭菌后，必须放入25 ℃～30 ℃温箱培养48 h，经检查无杂菌生长，即可保存待用。

（三）倒平板和摆斜面
1.制作斜面培养基
待灭菌的试管培养基竖置温度降至50 ℃左右时，将试管口端搁在厚度约1 cm左右的木条或其他器具上，使管内培养基自然倾斜，斜面的长度以不超过试管总长的1/2为宜，待凝固后即成斜面培养基。

2.制作平板培养基
倒平板须待盛有培养基的三角瓶或试管温度下降到50 ℃左右时进行，温度过高，皿盖上的冷凝水太多，易形成水珠落入培养基，造成污染。

温度低于50 ℃，培养基易于凝固无法制作平板。

先点燃酒精灯，右手托起三角瓶瓶底，左手掌边缘松动三角瓶棉塞后用小指和无名指拔出夹住（如果三角瓶内的培养基一次可用完，则棉塞不必夹在手指中）。

为防止瓶口沾染微生物污染培养基，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧。

用左手拇指和食指在酒精灯火焰附近打开培养皿上盖, 右手迅速倾入10～12 mL的培养基，盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转培养皿，使培养基均匀分布，冷凝后即成平板。

将平板培养基放室温2～3 d，或28 ℃培养24 h，检查无菌落及皿盖无冷凝水后即可使用。

四、作业
1.按要求数量制备斜面培养基，记载制备培养基的一般程序
2. 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？怎样检查培养基灭菌是否彻底?
3. 高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？。