亲和色谱
聚焦色谱

按实验技术分类 低压（小于0.5 Mpa) 中压 (0.5-5 Mpa) 高压 (5-40 Mpa) 电泳 (溶质在电场中移动）

根据固定相形状分类 柱层析、纸层析、薄层层析 根据流动相分类 气相层析、液相层析、超临界流体层析
按制备规格




⑴分析色谱（10mg） ⑵半制备色谱(10-50mg) ⑶制备色谱(0.1-1g) ⑷工业生产规模色谱(>20g/d)

层析材料的准备: 装柱前用溶剂平衡 凝胶层析材料：溶胀 吸附剂：加热或酸处理 离子交换剂：：酸碱处理
在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾 泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒 的堵塞，溶剂的流速将显著降低。
装柱



调糊：50%（缓冲液＋介质）
一次连续加入悬胶液，避免分层 打开出口阀：层析剂沉降
梯度洗脱
0.7 0.6 0.6 0.5
Protein（ mg/ml)
Protein NaCl 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 40 80 120
Volume (ml)
0.4 0.3 0.2 0.1 0 160 200 240
NaCl (mol/L)
部分收集
部分收集器：使每管按预定时间或滴数收集 流出液，然后自动移位，下一管再继续收 集。每一部分的蛋白质或核酸的含量可以 让流出液通过一个流动小室测定其280 nm或 260 nm的光吸收来进行连续监测。
纤维素

β -1,4 相连的D-G线性天然高聚物 （1）亲水 （2）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度

应用：离子交换分离蛋白质介质
聚丙烯酰胺
性质： （1）丙烯酰胺与交联剂N, N’-甲叉双丙烯酰 胺共聚 （2）控制交联剂比例可控制网格孔度 （3）亲水性不如多糖介质 （4）机械强度差 应用：凝胶过滤，电泳
层析装置与操作
装置



泵 混合器 层析柱 检测器 记录仪 分部收集器
层析柱
混合泵 蠕动泵 磁力搅拌器
分光光度计
酶试剂 紫外检测器
P-5
酶活性 双笔记录仪 部分收集器
紫外吸收
柱层析分离法的有关装置
柱操作 （1）装柱 （3）上样 （5）洗脱

（2）平衡 （4）洗涤 （6）清洗
（7）再生
清洗与再生



弱酸：HAC 碱：氨水 促溶剂：1-3M KCNS， 6-8 M 尿素，6 M盐酸胍 极性溶剂：20% 乙醇 表面活性剂 缓冲液平衡
亲和层析

亲和层析：利用生物体内存在的特异性相互 作用的分子对而设计的层析方法。 (1) (2) (3) (4) (5) 酶—底物或抑制剂 抗原—抗体。 激素—受体。 糖蛋白与凝集素, 生物素—生物素结合蛋白等
0 0 40 80 120 Elution (ml) 160 200 240
0
NaCl (mol/L)
分步洗脱
0.8 Protein
Protein (mg/ml)
NaCl
0.4
0.6
0.3
NaCl (mol/L)
0.4
0.2
0.2
0.1
0 0 40 80 120
Volume (ml)
0 160 200 240
1941
1952
Martin, Synge
Martin, James
提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作 为流动相（即气相色谱）。
从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。
1956
1957 1958 1965 1975 1981
Van Deemter
Golay Giddings Small Jorgenson


分类 特细孔硅胶 (0.8nm以下) 细孔硅胶（1.5—2.0nm ) 中孔硅胶 (4.0一5.0nm) 粗孔硅胶 (10.nm以上)
应用：优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物

琼脂糖
由海洋生物琼脂提取得到的主要成分 ①中性不带电 ②水溶性线状多糖 ③高亲水性，含大量羟基 ④能制成多孔性凝胶，分离大分子
分配色谱
溶质在固定相和流 分辨力高，重 影响因子多， 用于各种生物 动相中分配系数的 复性较好，能 上样量太小 大 分 子 的 分 析 差异 分离微量物质 鉴定 亲和色谱生物大分 分辨力很高 子与配体之间有特 殊亲和力 等电点和离子交换 分辨力高 作用 一种配体只 各 种 生 物 大 分 能用于一种 子 生物大分子， 局限性大 进口试制昂 蛋白质和酶 贵
B 环氧氯丙烷 （1）形成的共价键稳定,配基不易落脱 （2）自动引入手臂 （3）有更小的非特异性吸附, （4）活化操作简单易行,危险性相对较小 缺点：强碱性条件反应。
环氧氯丙烷活化反应式
环氧基的氨化及偶联配基反应

C 对甲苯磺酰氯活化 （1）用于含羟基基质,将羟基转化为磺酰基, （2）形成稳定化学键。 （3）在无水丙酮环境中进行。偶联配基在有 机相或水相中进行
色层分离法基本原理
分子筛层析示意图
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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分子量： >
>
层析的发展史
年代 发明者 发明的色谱方法或重要应用
1906
1931 1938
Tswett
Kuhn, Lederer Taylor Uray
用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念
用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始 为人们所重视。 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。

制备： （1）去除带电琼胶成分 （2）将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化等方法制得 珠状介质。 （3）采用交联剂增加介质的机械强度
商品种类

Sepharose 2B分离范围:70,000-40 ×106 , Sepharose 4B分离范围：60,000-20 ×106 , Sepharose 6B分离范围（球蛋白）：
10000-4×10 6 颗粒大小：40-165um:最高流速14cm/h 。


经过交联而增加机械强度的琼脂糖 Sepharose CL-2B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B 应用 ：水溶液中分离蛋白质
葡聚糖



α -1,6 相连的G聚合物，环氧氯丙烷交联 性质： （1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多） （2）化学稳定性及热稳定性好 （3）孔度与机械强度与交联度有关 （4）用于凝胶过滤 应用：水溶液中分离蛋白质等
层析分离法
色谱法(chromatography)——以试样组分在固定
相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他 亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方 法。



特点： （1） 纯化倍数高 （2） 操作规模小，放大困难 （3） 终产品纯化 （4） 适用于价格昂贵的产品
色层分离法基本原理
基本概念
分配系数； 解离常数； 分离因素； 阻滞因子； 溶出体积 ； 分辨率 ； 溶量因子
基本概念
（1）分配系数：溶质在固定相与流动相浓度比值 （2）解离常数：有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与 溶质在固相中的浓度比值 （3）分离因素：某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数 (4) 阻滞因子：分配层析溶质移动速度（距离）与 流动相移动速度（距离）比值
排除空气：沿着玻棒倾注 检查均匀度
关闭出口→用溶剂灌注至1／3体 积→加浆状物→放出过多溶剂 如二次填装，应先在已经沉淀 的表面用玻棒搅拌后再倾注。

用溶剂彻底洗涤层析 柱后使液面降到比层 析床表面略高一点。
上样



样品处理： (1）溶解 A 调整浓度：减少样品溶液体积，使区带狭窄 B 盐 C pH (2) 过滤：除去不溶物 流速：根据样品浓度与吸附速度而定 上样量：80%吸附容量
淋洗（去除残留在介质中的杂质）

盐浓度 pH 表面活性剂（0.1-0.5%) 淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定 防止产物丢失又要除去杂质
洗脱方法

按操作方式 a 恒定洗脱 (isocratic elution) b 分步洗脱 (stage elution) c 梯度洗脱 (gradient elution) 逐渐改变溶剂的性质，形成一个离子强 度、pH或极性的递增梯度从而使各组分依次 被洗脱 优点：减少拖尾现象

同种组分的分子分布离散(sepreading)：
入口处组分分布在一狭窄区带内，随着分子在柱
内迁移，分布区带不断展宽，同组分分子迁移速度出 现差异，主要是因为流体分子运动的速率差异造成， 不是平衡分布不同引起。
层析介质



要求： （1）不溶于流动相 （2）化学稳定 （3）机械强度 （4）大的表面积 （5）粒度均匀 种类： 无机（氧化铝，硅胶，活性碳） 有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺）
(5) 洗脱（容积）溶出体积 ： 在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的 流动相体积 (6) 分辨率 ：两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比 (7) 溶量因子： 固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比
色谱体系中样品运行特点

不同组分的差速迁移(differential migration):
混合物各组分在两相分配系数不同，分配系数大 的迁移速度慢，使同时进入色谱柱的各组分得以分离。
按洗脱机理 专一性洗脱（specific elution） 非专一性洗脱（nonspecific elution） 添加剂：乙二醇, NaCNS 、脲素、盐酸胍 洗脱体积：5倍床体积