超净工作台
接种箱
臭氧灭菌器
接种工具
• 二、无菌操作
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• 无菌操作是食用菌制种工作成败的关键，它包括两方面内容，
一是制种过程中使用的全部材料是无菌的．二是必须采用无菌
操作方法(也包括培养条件)两者结合起来，才能保证制种的全
部过程是无菌的，才能培养出纯菌种。
• 1.高温灭菌 • （1）常压蒸汽灭菌（用于菌种灭菌）
3.制作步骤
马铃薯200 克去皮切块 （1厘米见 方） 放入汤锅中加入适 量清水煮沸15分钟， 用纱布过滤，留滤 汁备用 滤汁倒入汤锅，先加入17 克琼脂，加热搅拌，融化 后，再加入20克葡萄糖， 融化，用量杯定容至1000 毫升
试管分装：将溶液 加入试管中，每管 加入到1/5处，加 盖棉塞
摆斜面：将灭好菌的试管 取出，按一定倾斜度摆好， 带培养基凝固后备用
食用菌菌种制作
菌 种 制 作 的 一 般 流 程
• 第一部分：培养基制备
• 一、试管PDA（母种）培养基制备 1.所需原料：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂17克、水1000克
马铃薯
葡萄糖
琼脂
2.所需设备工具 手提高压灭菌锅、煤炉或电磁炉、汤锅、试管、棉塞、分装装置
手提高压灭菌锅
试管
橡胶塞
简易分装装置
接 种 箱
• 6.接种操作 • 在无菌的环境条件下，将优良的菌种移接到灭好菌的培 养基中。 • 优良菌种的标准：优良的菌种应该是菌丝浓密洁白，生 长均匀，分布一致，有芳香味，无污染。
接种操作
• 第三部分 菌种培养
• 一、培养菌种所需的环境条件 • 1.合适的温度（一般都在25℃左右，个别高温品种如草菇在 31℃）。 • 2.黑暗环境（不需要光照）。 • 3.环境空气湿度60%-70%。 • 二、注意事项： • 要经常性的检验，每格4-5天检验一次，把污染杂菌的菌种袋 （瓶）挑出来作安全性处理。 • 试管种大概7天左右就能长满，菌种袋（瓶）大概30-40天就能长 满。
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(2)硫磺：常用在按种室，培养室熏蒸，用晕15g、m3，关闭 门窗，点燃熏蒸，密闭12h。 (3)高锰酸钾：0.1％的高锰酸钾，用于T具，器皿和手的消 毒。 (4)来苏儿(煤酚皂液)：3％的来苏儿，用于器皿或室内喷雾 消毒。 (5)石碳酸：3-5％的石碳酸，用于器皿消毒或室内喷雾消毒。 (6)新洁尔灭：0.l-0.25％的新洁尔灭，用于器皿消毒或室 内喷雾消毒。
配料 拌料 装袋（瓶） 灭菌 接种 培养
4、所需设备、材料 拌料机、菌种袋（瓶）、装袋机、灭菌设备（高压灭菌、常压灭菌） 5、场地：地面清洁、准备冷却室
拌料机
菌种袋
装袋机
常压锅炉
常压灭菌现场
高压灭菌锅炉
第二部分：接种
一、所需工具、设备
超净工作台、接种箱、接种钩（铲、钯、镊子）、酒精灯、气雾消毒剂（臭氧消毒器）
• 3.化学药物杀菌 • (1)甲醛(福尔马林)：40％甲醛溶液用于接种箱，接种室，培养 室熏蒸消毒，用量6-8ml／m3，加热时挥发产生气体对空气杀菌， 有两种方法：①直接加热熏蒸，关闭门窗，按空间大小称其用量， 倒入铁或铝盒中，放在酒精灯上或电炉上加热，挥发出甲醛气体密 闭24h，②氧化熏蒸：高锰酸钾与甲醛混合熏蒸，因为高锰酸钾是 种氧化剂，与甲醛混合时产生氧化还原反应，使甲醛挥发为气体， 甲醛与高锰酸钾比例为2：1．将甲醛倒入瓷碗中，再按2：1比例加 入高锰酸钾，混合后立即产生气体，甲醛熏蒸应在使用前24h进行。 甲醛蒸气对眼黏膜，呼吸道有强烈的刺激作用，且有毒，熏蒸后短 时间不能入室工作，待甲醛蒸气散消后才能入室工作。
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(7)75％酒精：接种时用于擦手或瓶口等。 (8)石灰：石灰分生石灰和熟石灰两种，熟石灰配成1％-3％石灰 水，用于地面，墙壁消毒，生石灰用于地而墙壁消毒，畦底可撒石灰 粉消毒，菌床，菌砖等局部发现杂菌可撒石灰粉消毒。 • (9)多菌灵或托布津：生料栽培叫用O.1％-0.2％多菌灵或托布津 拌入料中防止杂菌污染。 • (10)苯菌特：是种高效低毒广谱的内吸杀菌剂，用法同多菌灵。 • • 以上消毒药品叫根据情况选用，为避免杂菌产生抗药性，可轮换使用， 以提高杀菌效果。
• 将灭菌物品(培养料)放在蒸笼内蒸煮，从开锅(100℃)开 始算起．连续加热开锅4-12h达到彻底灭菌，个体户或菌种厂 自制的灭菌灶，在生产原种、栽培种或栽培菌袋时，均采用此 法灭菌，此法简单，适用，成本低。
特点：简单、低成 本，灭菌时间长
• （2）高压蒸汽灭菌（用于菌种灭菌） • 高压蒸汽灭菌是生物灭菌技术中应用最广，灭菌时间短， 效果最佳的灭菌技术，原理是根据蒸汽温度随压力增加而提高， 压力越大温度越高的原理。水在封闭的灭菌器中(高压灭菌锅 中)，通过加热使灭菌器中的水产生水蒸汽，在排除灭菌器内 冷空气后，关闭排气阀，蒸汽不能逸出，增加了灭菌器中的压 力，水的沸点或蒸汽的温度随之上升，因而获得了比100℃更 高的温度，达到有效灭菌的目的。一般培养基在高压灭菌器中 待压力升到1.05kg/cm2(121℃)时灭菌40min，也可在1.5kg／ cm2(126℃)灭30min，达到彻底灭菌，如灭固体培养料在1.5kg ／cm2灭菌1-2h即可；高压灭菌器有手提式、立式、卧式等多 种型号，热源有电源，煤，煤气，蒸汽等等。
高压灭菌：将分装好的试 管放入灭菌锅中灭菌，达 到1.05kg/cm^2压力时 （121摄氏度），保持15备
1.所需原料 （1）主料：木屑、棉籽壳、玉米芯等 （2）辅料：麦麸、玉米粉等 2.配方（以平菇为例）： （1）木屑78%，麸皮20%，石膏1%，石灰1%。 （2）棉籽壳88%，麸皮10%，石灰2%。 3、流程：
特点：灭菌时间短、效果好，但是造价高，有一定危险性
• （3）火焰灭菌（用于接种时接种工具灭菌） • 接种环，接种钩，接种铲．镊子等金属器皿可直接 在酒精灯火焰上烧灼灭菌，试管口，瓶口也要通过火焰 达到灭菌目的，方法简单迅速，灭菌彻底。
• 2.紫外线杀菌（用于接种室、接种箱） • 波长在2600-2800的紫外线有很强的杀菌能力，电子通过 水银蒸汽可产生波长：1357A的紫外线，以此制成的紫外线 灯管，杀菌力强而稳定，距被照物体20-30厘米照射3-5分 钟，即可杀死细菌的营养体，十几分钟就杀死细菌的芽孢， 紫外线灯管在生产实践中应用较广，用于空气消毒，但穿 透力不大，只能用于表面消毒。接种室，接种箱，手术室， 药厂等均可安装，接种箱安15w，按种室可视大小安30w或 100w．照射30min即可达到灭菌目的．紫外线对眼黏膜，视 神经，皮肤等均有杀伤力，故不能在开着的紫外线灯下工 作，必要时需穿防护衣帽，并戴上有色眼镜工作。
菌种培养室
• 5.接种箱的设计与要求 • 接种箱是木柜镶玻璃结构，大小不一，一般为100cm×70cm×50cm，要求严 密，操作口要安装套袖，箱上方装15w紫外光灯，两侧设有能开关并且严密的 门，以便取放接种物品。 • 接种室、接种箱要保持清洁，使用前进行消毒。 • 消毒方法： • (1)熏蒸：用甲醛，硫磺或甲醛与高锰酸钾混合进行熏蒸，按空问大小称 其用量，关闭门窗密闭24h，熏蒸完毕，打开门，待甲醛气体扩散后，再入室 工作。 • (2)喷撒：用3％来苏儿或5％石碳酸向地面喷撒，向空气喷雾以及擦洗桌 面进行消毒。 • (3)超净工怍台：超净工作台是利用多层滤板过滤空气，使操作台上的空 气得以净化，是接种的良好设备。操作台安有15w紫外线灯，接种前照射30min， 关灯后工作。
• 气雾消毒
可以替代甲醛、硫磺等用来熏蒸
• 4.无菌室(接种室)的设计与要求 • 无菌室应分里外两间，里间为接种室，面积5-6m2，外间为缓冲间，而 积为2-3m2,两间高度均为2-2.5m，过大不易保持无菌状态，房问的地板， 墙壁，天棚要平整光滑，便于擦洗消毒，门设拉门，门窗能关严密闭，接 种室，缓冲间均应安装紫外线灯，接种室应备有酒精灯，火柴，接种钩， 接种铲，剪刀，镊子，75％酒精棉球等等．缓冲间应备有工作服托鞋，帽 子，口罩，消毒药品，喷雾器等等。