实验一病料的取材和送检目的1.学会被检病料的采取、保存、包装和记录方法内容和方法（一）注意事项：1．剖检前的检查急性死亡，镜检末梢血中是否有炭疽菌存在；须排除炭疽；疑为炭疽禁止剖检。

2．器械的消毒，操作应注意无菌。

3．合理取材（1）首先了解该传染病的流行情况、临床症状、病理解剖检查。

（2）针对性，采集合适的样本进行检验/全面取材，即根据不同的传染病，相应地采取该病常侵害的脏器或内容物，如败血性—心、肝、脾、肺、肾、淋巴结等；肠毒血症—肠内容物；神经症状—脑；无法估计—全面采集。

（3）微生物学检查，所采样本应未经抗菌素治疗者。

4．取材时间越早越好，一般＜4~6h。

5．顺序接种培养→采样→剖检→病理。

6．作好个人防护与环境消毒。

（二）病料的采取1．组织、脏器：供病理切片2×2cm2．血液、血清：供血清学反应可加入5%石炭酸1~2滴；全血采集应加入抗凝剂。

3．脓汁、创伤感染样品4．鼻咽分泌物5．粪便6．胃肠内容物（三）病料的保存1．细菌检验病料_30%甘油缓冲盐水；2．病毒检验病料_50%甘油缓冲盐水；3．病理组织学材料_10%福尔马林溶液，1:10；24h后换液一次。

（四）病料的运输1．标号(样本、包装)，记录，附病料送检单（一式两份）：详见教材pag21。

2．包装容器密封、冷藏/不冷藏试验二免疫接种目的：1. 掌握免疫接种的方法、步骤2. 熟悉兽医生物制品的保存、运输、用前检查方法内容及方法（1）生物制品的用前检查外包装：瓶签、密封性等；生物制品的用前检查（1）购买专业化知名疫苗生产厂具有正式批准文号的疫苗。

（2）购买时应检查外包装、制品名称、产地、生产厂名、批号、有效期、物理性状、贮存条件等是否与说明书相符。

如有瓶子裂纹、胶塞松动、油乳剂破乳、色泽及其它物理性状与说明书不符者不得使用。

生物制品的保存、运输（）严格按照说明书的要求进行运输、贮存和保管，特别是要求低温保存的冻干苗应更加注意原则：低温、干燥灭活苗、免疫血清等应保存在2~15℃，防止冻结；弱毒苗应置于0℃以下，冻结保存。

免疫前注意：（1）根据实验室监测情况，制定免疫程序，决定免疫时间。

（2）免疫接种只针对健康畜群。

（3）接种前后应减少应激反应，弱毒菌苗前后各10天不得用抗生素和含抗生素类药物的饲料；免疫病毒活苗前后各7天不能用抗病毒药物，但可在饮水或饲料中添加抗生素、维生素等抗应激的物质。

（4）免疫当天禁止对畜禽舍消毒。

（5）搞好器械消毒。

最好用高温、蒸煮等方法消毒，不要用化学消毒剂消毒针头、注射器及其它直接接触疫苗的容器。

（6）用前检查：疫苗说明书与瓶签是否相符，检查物理性状、贮存条件等，如有瓶子裂纹、胶塞松动、油乳剂破乳、色泽及其它物理性状与说明书不符者不得使用。

（7）使用专用稀释液或清洁、不含氯等任何消毒剂的生理盐水、蒸馏水、凉开水或深井水进行稀释，（8）禁用金属容器，器皿应清洁，无洗涤剂和消毒剂残留接种方法及步骤方法：1.饮水2.滴眼滴鼻3.肌肉或皮下注射4.气雾免疫5.翼膜刺种6.擦肛1、饮水免疫关于饮水免疫的优缺点：A 减少应激，节省人力；但疫苗损失较多。

B 雏鸡的强弱或密度会造成饮水不匀，免疫程度不齐。

饮水免疫注意：（1）接种前24h饮水中不能加入消毒剂。

禁用金属容器，器皿应清洁，无洗涤剂和消毒剂残留。

（2）用清洁、不含氯等消毒剂和铁离子的凉开水、深井水；加1~2﹪脱脂奶或加入5克/L脱脂奶粉以延缓疫苗效价的衰减时间。

（3）免疫前停水２~４h，以确保２/３的鸡同时饮水。

（4）确保疫苗在１~２h内用完。

（5）通常疫苗使用量比瓶签标注量应至少增加一倍。

2、滴眼、滴鼻免疫雏鸡早期接种弱毒疫苗常用此法。

该方法的优点体现在：局部免疫和体液免疫共存。

滴鼻时为了使疫苗很好地吸入，可用手将对侧的鼻孔堵住，让鸡吸进去。

滴眼时，握住鸡的头部，面朝上，将一滴疫苗滴入面朝上一侧的眼皮内，不能让其流掉。

一只一只免疫，防止漏免。

3、肌肉或皮下注射免疫效果准确，但有费力和产生应激等缺点。

（1）健康鸡群先注，弱鸡最后注射。

（2）肌肉注射以翅膀靠肩部、胸部肌肉为好。

（3）颈部皮下注射，远离头部。

4、气雾免疫在短时间内，可使大量鸡吸入疫苗获得免疫。

多用于加强免疫，本法为刺激呼吸道粘膜，所以避免在初次免疫时使用。

对于有鸡毒支原体感染/患其他慢性呼吸道病的鸡场可导致严重不良反应，应慎用。

气雾免疫注意（1）用量按鸡舍设计和饲养量计算并适当增加（通常加倍），稀释液每1000只平养鸡用量为200~400毫升，用适当粒度（30~50µm）的喷雾器在鸡群上离鸡0.5m处喷雾。

让鸡充分吸入空气中带疫苗病毒的雾滴。

（2）免疫前应关闭门窗和通风系统，喷雾结束后至少保持30分钟然后再通风，以取得良好的免疫效果。

5、刺种免疫接种针应在翼膜无血管处穿刺，病毒在穿刺部位的皮肤处增殖产生免疫。

对于各种方法的免疫后应注意（1）剩余药液及疫苗瓶应进行消毒做无害化处理，不可乱扔，以免散毒污染环境。

（2）一般5—7天（油苗10—15天）才产生抗体，故应严格控制环境卫生，以免在产生免疫力前感染强毒导致免疫失败。

（3）注意观察鸡群反应情况，出现异常及早采取措施。

（4）做详细记录，登记疫苗批号、使用日期、使用量等，并保留同批样品两瓶，出现不良反应及时处理，查找原因。

实验三炭疽实验室诊断目的：1、掌握炭疽实验室诊断的方法步骤。

实验材料：显微镜、载玻片、剪刀、镊子、瑞氏染液、普通琼脂平板、接种环、酒精灯、恒温培养箱、炭疽沉淀素、炭疽标准抗原、生理盐水、平皿、试管、乳头滴管、水浴锅/电炉实验动物及样本：送检病料/接种炭疽无毒芽孢弱毒疫苗的小白鼠实验内容：1. 形态学诊断：(1) 取病畜濒死或刚死亡动物的血液/组织→涂片（触片）(2) 用瑞氏染色法染色※(3) 镜检注：瑞氏(Wright)染色法a涂/触片→自然干燥b瑞氏染液染1min加等量pH6.4磷酸盐缓冲液→晃动玻片→混匀→静止5 min水洗→吸干→镜检2. 培养检查无菌取材→接种普通培养基→37℃,18~24h→观察菌落3. Ascoli试验a.取沉淀反应管3支→各加0.1ml炭疽沉淀素血清。

b.将待检抗原→沿管壁轻轻加入其中一支,使其重叠在炭疽沉淀素血清上，使上下两液间有一整齐界面。

c.另二支沉淀反应管，其中一支加炭疽标准抗原;另一支加生理盐水，作为对照，方法同上。

d.将反应管直立静置，3-5min内判定结果。

实验四布氏杆菌病的检疫目的：1. 掌握布氏杆菌病的血清学检疫方法2. 熟悉布氏杆菌病的血清学诊断的操作方法和结果的观察、判定原理：颗粒性抗原（细菌等）与相应的抗体混合后，在电解质的参与下经过一定时间，抗原抗体凝集成肉眼可见的凝集块，这种现象称为凝集反应。

直接凝集反应可分为玻片凝集与试管凝集。

(一)平板凝集反应材料与试剂1. 玻璃板、刻度吸管2. 布氏杆菌凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清、布氏杆菌标准阴性血清、待检血清、生理盐水。

实验方法：1. 取一洁净玻片，用蜡笔划成方格，编号2. 各方格分别加待检血清0.08、0.04、0.02、0.01 lm3. 对照：阳性-阳性血清；阴性-阴性血清4. 用牙签混匀，摊开直径1cm左右6. 静置3-4分，再拿起玻板轻轻转动，按下列标准记录反应结果：++++ 出现大的凝集块，液体完全清亮透明，即100%凝集+++ 有明显凝集片和颗粒，液体几乎完全透明，即75%++ 可以看见颗粒，液体不甚透明，即50%凝集+ 仅仅可以看见颗粒，但液体混浊，即25%凝集- 液体均匀混浊，无凝集现象7. 结果判定：(二)试管凝集反应材料与试剂1. 试管、试管架、刻度吸管、恒温箱2. 布氏杆菌凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清、布氏杆菌标准阴性血清、布氏杆菌待检血清、生理盐水。

实验方法1.每份血清用4支试管，别取对照管3支，共7支。

2.稀释血清和加入抗原的方法如下：各管按下表所示加入0.5%石炭酸生理盐水，后加0.2ml被检血清至第1管中，混匀，吸出1.5ml弃去，再吸0.5ml至第2管，混匀，吸0.5ml至第3管，依次至第4管，混匀，吸弃0.5ml，第5管中不加待测血清，第6管中加1:25稀释的布氏杆菌阳性血清0.5ml，第7管中加1:25稀释的阴性血清0.5ml。

3.各管加入抗原后，七管同时混匀，37 ℃4~10h，取出后室温18~24h，观察并记录结果4. 确定血清凝集价时，应该出现++以上凝集现象的最高稀释度为准。

24小时后观察结果++++ 出现大的凝集块沉于管底，液体完全清亮透明，即100%凝集+++ 有明显凝集片和颗粒沉于管底，液体几乎完全透明，即75%++ 可以看见颗粒沉于管底，液体不甚透明，即50%凝集+ 仅仅可以看见颗粒，液体混浊，即25%凝集- 液体均匀混浊，无凝集现象判定标准：牛、马和骆驼凝集价1：100以上；猪、山羊、绵羊和狗1：50以为上阳性。

牛、马和骆驼1：50；猪、羊等1：25为可疑。

实验五鸡新城疫的免疫监测目的:1.掌握鸡新城疫血清学诊断和免疫监测的方法2.了解鸡新城疫血清学诊断免疫监测的判定标准血凝试验（AI）和血凝抑制试验（HI）—β微量法实验原理HA新城疫病毒纤突上含有血凝素，能不同程度地凝集某些动物的红细胞HI新城疫病毒+红细胞→红细胞凝集新城疫病毒+抗体→抗原抗体复合物+红细胞→红细胞不凝集材料与试剂1. V型血凝板、加液枪、刻度吸管2. 新城疫抗原、阳性血清、阴性血清、待检血清、生理盐水、1%的红细胞。

HA方法：（一）血凝试验（HA）：取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12。

3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。

4、室温静置10-30分，观察结果。

5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。

结果判定：以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。

注意:由于新城疫病毒含有神经氨酸酶，它能破坏红细胞表面的血凝素受体，使凝集的病毒从红细胞上解脱下来，所以要及时观察结果。

HI方法（二）血凝抑制试验（HI）：取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价乘4即为4个单位血凝素的稀释度。

2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul 待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔…,依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释度为2-1~2-12。