大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜的作用彭 程 肖永红[摘要] 目的:研究大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜的影响。
方法:用高分子膜片制备铜绿假单胞菌生物膜,计数滤膜菌落与扫描电镜观察,观察大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜形成前后的影响及对已形成生物膜的清除作用。
结果: 2mg/L阿奇霉素、2mg/L红霉素可抑制生物膜的形成,生物膜菌落计数由对照10.0×109cfu/cm2,分别降至1.9×103cfu/ cm2、5.0×103cfu/cm2。
麦迪霉素作用不明显;单用阿奇霉素、红霉素及麦迪霉素不能清除已形成的生物膜,但阿奇霉素、红霉素与环丙沙星协同作用,可使已形成生物膜中细菌下降至0.9%～2.2%。
电镜观察与上述结果一致。
结论:红霉素、阿奇霉素能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,增强环丙沙星对生物膜的渗透性,增强其杀灭生物膜内细菌的作用,清除生物膜;麦迪霉素对生物膜的形成及清除均无影响。
[关键词] 大环内酯类药物; 铜绿假单胞菌; 生物膜中图分类号:R978.1+5 文献标识码:A 文章编号:1009-7708(2001)01-0007-03Effects of macrolides on Pseudomonas aeru ginosa biofilmsPENG Cheng,X IAO Yong-hong(Department of In fectious Diseases,the First A ffiliated Hospital, Chongqing U niversity of Medical Scienc es Chongqing 400016,China)[Abstract]Purpose:T o investig ate the effects of macrolides on Pseudomonasmol aeruginosa biofilms.Methods:Pseudomonas aerugi-nos a bio film was prepared using high malecular membrane,the number of colonies in biofilm were counted,then observed by scanning electron microscopy.Results:The number of colonies in biofilms w ere reduced from10×109cfu/cm2in co ntrolled biofilmm to1.9×103cfu/cm2treated with2mg/L azithromycin,and to5.0×103cfu/cm2treated with2mg/L ery thromycin.T he number of colonies in biofilms treated with azithromy cin,ery thromy cin or medemycin alone had no significant effect on biofilm,however w hen treated w ith azithromycin or erythromycin in combination with ciproflo xacin,the number of colonies decreased to0.9%-2.2%of the orig i-nal.N o sig nificant change was observed when medemycin combined with ciprofloxacin.Similar results were obtained when observed w ith scanning electron microcopy conclusions.C onclusions:T hese results indicate that azithromy cin and erythromycin can inhibit the formation of biofilm by P.aerugino sa;enhance the bactericidal actio n of ciproflox acin on bacteria within the bio film.M idecamycin has no such effect.[Key words] M acrolides; Ps eudomonas aeruginos a; Biofilm 生物膜(biofilm,BF)是一种膜样结构,是由细菌通过胞外多糖复合物或(和)纤毛共同作用粘附在生物材料或人体组织表面,不断分裂繁殖,分泌大量胞外多糖复合物(主要成分为藻酸盐)而共同形成的。
由于BF内细菌代谢、繁殖缓慢,其对抗生素不敏感;BF基质胞外多糖通过吸附与机械阻滞抗生素分子进入BF;BF表层细菌被杀灭后,释放出抗生素灭活酶,如β内酰胺在体内不易被人体的免疫系统清除等[1～3],使BF清除十分困难,常致顽固性感染。
能形成BF的细菌主要有铜绿假单胞菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、肺炎链球菌、葡萄球菌属等,相关感染尤以铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌多见。
本工作通过菌落计数测定铜绿假单胞菌BF 作者单位:400016重庆医科大学附属第一医院感染科中细菌量及扫描电镜观察BF的变化来研究大环内酯类药物对BF形成的影响及对BF的清除作用。
材料与方法一、药物红霉素(ery thromy cin,EM)标准品购于重庆市药品检测所,阿奇霉素(azithromy cin,AZ)为山东齐鲁制药厂产品,麦迪霉素(midecamy cin,MDM)为日本明治制药厂产品,环丙沙星(ciprofloxacin,CPFX)为重庆制药六厂产品。
二、培养基与菌株所用培养基为Mueller-Hinton肉汤(MHB)与Mueller-Hinton琼脂(MHA),菌株为粘液型铜绿假单胞菌(编号970558-26),为本院临床分离。
三、抗生素对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(M IC)的测定采用试管二倍稀释法稀释,测定上述药物对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度M IC值。
四、铜绿假单胞菌BF的制备按文献[4]方法,将隔夜培养的铜绿假单胞菌调制菌液浓度至0.1×106cfu/ml,取0.25ml加入5 ml MHB中,同时加入已高温蒸气灭菌的聚碳酸酯膜片(0.2μm孔径,购于Sigma公司)或硅胶片(两种膜片均用打孔器制成直径0.7cm的圆片),置于37℃下孵育24h,即得已形成BF的膜片。
五、铜绿假单胞菌BF细菌计数已形成BF的聚碳酸酯膜片用无菌生理盐水1 ml冲洗游离菌后,放入3ml无菌生理盐水中,用匀浆器(ZS83-1型,浙江机械厂)粉碎后,用连续稀释法进行菌落计数,制备生物膜同时加入不同抗菌药物以观察药物对生物膜形成的抑制作用。
实验重复3次,计算平均值,以不加药物所形成的BF为对照[4]。
已形成BF的硅胶片用无菌生理盐水1ml冲洗游离菌后,放入5ml MHB中(其中分别含有1/16 M IC大环内酯类药物、3M IC环丙沙星或两类药的两两组合),置于37℃下孵育,每隔1h取出1枚硅胶片,冲洗后,放入3ml无菌生理盐水中,用涡漩振荡器充分振荡3min后,用连续稀释法进行菌落计数,以不加药物MHB中BF的变化为对照[5],观察药物对BF的清除作用。
六、扫描电镜观察BF以聚丙烯酰胺膜片(0.2μm孔径,北京化工学校附属工厂,制成面积0.7cm2的方片)按上述方法制备BF标本,以生理盐水冲洗掉表面游离菌后,置于2.5%戊二醛中,4℃前固定2h,再用1%四氧化锇后固定30min,脱水、置换、干燥、喷金,通过扫描电镜观察BF形态。
以上述细菌计数法,在生物膜制备的不同阶段加入抗菌药物,观察药物对生物膜形成的抑制与清除作用。
结 果一、抗生素对铜绿假单胞菌的MIC值各种抗生素对铜绿假单胞菌970558-26的M IC值分别为,EM32mg/L,AZ32mg/L,M DM 512mg/L,CPFX0.0625mg/L。
二、大环内酯类药物对铜绿假单胞菌BF形成的抑制作用1/16M IC EM(2mg/L)及AZ(2mg/L)能显著抑制BF的形成,而1/16M IC M DM(32mg/L)对BF形成无确切影响;与无药对照菌落数10×109 cfu/cm2比较,三者所得菌落数分别为1.99×103、5.01×103与7.94×109cfu/cm2。
由图1及图2可见,扫描电镜图像结果与菌落计数一致。
图1 未加药形成的铜绿假单胞菌BF大量的细菌粘附在膜片上,呈凹凸不平的网状,菌体典型,细菌外被较多的粘液状物质(×2500)图2 1/16M IC AZ对铜绿假单胞菌BF形成的影响细菌(→)少见,散在分布于膜片(■)上,未见粘液状物质(×3040)三、大环内酯类药物对铜绿假单胞菌BF的清除作用单用1/16MIC大环内酯类药物或是3M IC-CPFX对已形成的铜绿假单胞菌BF清除作用不明显。
但1/16M IC EM或AZ与3M IC CPFX联用后对已形成的铜绿假单胞菌BF有明显的清除作用,而MDM与CPFX联用后作用不明显(表1,图3)。
表1 大环内酯类药物与环丙沙星联用对铜绿假单胞菌BF的清除作用药 物＊BF菌量改变(%)0h1h2h3h4h5h无药对照10099.787.575.0110.5117.0阿奇霉素/环丙沙星10022.48.53.41.20.9红霉素/环丙沙星10037.610.24.82.52.2麦迪霉素/环丙沙星100107.095.3106.077.654.1 ＊大环内酯类药物浓度为1/16M IC,环丙沙星浓度为3M IC图3 3M IC CPFX合用1/16M IC AZ对已形成的铜绿假单胞菌BF的影响药物与BF作用5h;残留细菌相互连接成稀疏的网状结构(→),可见少量块状或丝状的粘液物质 (×200)讨 论本研究中,1/16MIC AZ(2m g/L)、EM(2mg/ L)可使铜绿假单胞菌BF菌落计数由对照组10.0×109cfu/cm2降为1.9×103cfu/cm2、5.0×103cfu/ cm2预先制备的BF置入含有1/16M IC大环丙酯类药物或3M IC CPFX中孵育5h,BF菌落计数为用药前的79.4%～158.5%,3M IC CPFX和1/16 M IC的AZ或EM联用作用则可使其菌量下降至0.9%和2.2%,为单用3M IC CPFX的1.0%和2.5%。