培养基模拟生产验证1 概述：对无菌灌装过程进行胰酪胨大豆肉汤培养基模拟灌装试验，通过对其污染率的测试，来确认预充式无菌灌装过程和各种规程防止微生物污染的水平能达到可接受的合格标准。

2目的与范围：2.1无菌生产环境、人员消毒卫生状况与产品无菌保证的验证。

2.2用棉球擦拭的方法验证设备设施清洁消毒效果。

2.3验证的试验过程中监测底塞、卡式瓶的无菌性，使之始终符合卡式瓶生产工艺要求。

2.4验证除菌过滤的可靠性，保证生产出合格的中间体半成品。

2.5验证物料转移过程中物料的无菌性，使之满足卡式瓶生产工艺需要。

2.6模拟无菌灌装试验来考察灌装操作过程微生物的污染率不大于0.1%，进而证明灌装工艺条件符合无菌灌装的工艺要求。

2.7通过轧盖密封后瓶内抽真空进行气密性测试，证明与轧盖相关的工艺条件符合卡式瓶生产工艺要求。

3 职责：3.1相关生产人员必须依照本规程进行生产操作。

3.2生产部门负责人及QA负责指导与监查本文件的执行。

3.3文件的修定和定期审核应由生产部门负责人员和QA负责。

3.4所有参与本验证过程的生产人员都必须依照本方案进行生产操作。

3.5验证过程应严格按照规定的内容进行，若因特殊原因确实需要变更时，应填写验证方案变更申请及批准书（附表1），报验证委员会批准。

4 参考文献：4.1Validation of aseptic filling for solution drug product4.2药品生产验证指南（2003 版）5设备及仪器：6物料7验证内容7.1判断标准产品无菌性的可信限：95%产品允许污染的概率：警戒限为＜0.05%，可信限为＞0.1%7.2培养基配制、灭菌和过滤：7.2.1按30g胰酪胨大豆培养基溶于1L 蒸馏水的比例配制适量的培养基溶液，搅拌并加热溶解或直接量取70℃以上的蒸馏水，搅拌溶解后，，将盛放培养基的桶在蒸汽灭菌柜内121℃灭菌15 分钟，待灭菌后自然冷却7.2.2配制用于验证分装生产线的无菌性的培养基溶液体积应满足灌装3000支以上的量（一般灌装5000 支左右）。

7.2.3冷却后用已灭菌的0.22um 的套筒过滤器过滤于已灭菌的相应容量的不锈钢桶中。

注：过滤过程应遵守无菌操作。

7.3培养基无菌性试验：将用于模拟灌装的胰酪大豆培养基另外用50ml 试管配制4 管（20ml/管），在121℃灭菌15 分钟，盖塞、封口后将其中2管在20～25℃培养7天，另外2管在30～35℃培养7天。

7天内若各试管中应无任何微生物生长，则判断合格。

结果填于附表27.4培养基微生物生长性能试验：将配制好的灭菌培养基分装于10 支50ml 试管中（20ml/ 管），在其中４支管内接种＜１００ＣＦＵ的枯草杆菌，和1 支不接种枯草杆菌的TSB试管（空白对照）同时在30～35℃下培养7 天，在另４支试管内接种＜１００ＣＦＵ的白色念珠菌，和1 支不接种白色念珠菌的ＴＳＢ试管（空白对照）同时在20～25℃培养７天，培养过程中每天观察微生物生长情况，七天内若50%以上接种的各试管的培养基应出现明显的所接种的微生物的生长，空白试验无菌生长，则判断合格。

结果填于附表3。

7.5无菌灌装试验：7.5.1无菌灌装所用的瓶和塞塞经灭菌处理后，进行模拟灌装、轧盖。

每瓶和托盘都需标号，每盘上记录起始时间和结束时间。

整个过程应严格遵守相应的无菌灌装生产的标准操作规程。

模拟灌装生产的全部样品先在20～25℃培养７天，再在30～35℃下培养7 天，一半倒置培养，一半正立培养。

培养过程中应每天观察微生物生长情况，若发现污染应明确记录瓶号、瓶数。

7.5.2阴性对照：灌装过程中随机抽取2 瓶不进行设备灌装直接手动加底塞、灌装培养基、封口，与试验样品同条件培养作为阴性对照。

7.5.3随意地取出8 支灌有培养基的灌装瓶，向挑选出来的4 支瓶内逐个注入0.1ml 的枯草杆菌混悬液（每0.1ml 中CFU少于100个），在30～35℃下培养7天，向挑选出来的另4 支瓶内注入白色念珠菌混悬液（每0.1ml 中CFU少于100 个），在20～25℃培养７天。

如果在7 天内，50%以上接种卡式瓶的培养基里都出现繁殖现象，则判为合格。

对瓶内的繁殖情况要进行目检，对污染的卡式瓶要点清数量（如有污染菌的话）。

污染了的卡式瓶必须仔细检查是否有瓶、塞、盖的损坏情况。

7.5.4试验结果评价评价无菌模拟灌装试验结果的主要指标之一是微生物污染率，其计算方法如下：污染率水平=[微生物生长的瓶数/ （总分装瓶数-破损瓶数）] ×100% 如果在14 天的培养期内，其污染率大于0.1%，则应立即停止生产，调查污染产生的原因应检查铝盖、底塞的密封情况，若有破损应记录并检查其破损原因。

原因找到后立即重复进行无菌灌装模拟试验。

重复模拟灌装试验连续进行3 次，2 次均符合要求才可以认为此灌装工艺过程符合无菌灌装要求。

7.5.5灌装原始纪录作为附件，试验结果如附表4 填写7.6 内包材的无菌试验a）卡式瓶无菌试验：试验前取灭菌后灌装前2支作无菌检查，试验过程中每灌大约1000瓶时在振料器上取2 支作无菌检查，试验结束后在振料器上取2 支作无菌检查。

b）底塞无菌试验：底塞灭菌卸料时取2 支作无菌检查，试验过程中每灌大约1000瓶时理塞盘上取2 支作无菌检查，试验结束后在理塞盘上取2 支作无菌检查。

c）复合铝盖无菌试验：灭菌卸料时取2 支作无菌检查，试验过程中每灌大约1000 瓶时在理复合盖盘上取2 支作无菌检查，试验结束后在理复合盖盘上取2 支作无菌检查。

d）判断标准：阴性e）按附表5 填写结果。

7.7人员：7.7.1参加人员：7.7.2人员培训：查阅操作人员个人培训档案，确认上岗操作人员已按培训计划进行基本生产技术培训, 并进行人员净化消毒效果的检查。

c）判断标准：①上岗操作人员已经接受了生产技术培训，②能按规程进行人员物料净化对设备设施正确清洗消毒③能规范操作，减少人员对环境造成污染。

d人员无菌监测：人员更衣完毕用棉球擦拭法在手、前胸处取样作无菌性试验。

取样时间分别在试验前、试验过程中、试验结束用棉球擦拭法各取样1 次检查操作人员上述部位细菌总数，按下表填写检验结果：7.8 生产环境监测7.8.1 设备设施表面的微生物数量7.8.1.1 判断标准：设备设施表面的微生物数量应符合相对应表面的微生物限度要求7.8.1.2试验方法：用棉球擦拭法在试验开始前、中、后，在指定的取样点取样作无菌检查。

用灭菌的生理盐水润湿棉球，充分擦拭生产区最难清洁的部位，棉球取样面积为25cm2/ 个然后棉球放入带有灭菌的生理盐水的三角瓶中，充分振摇，然后进行微生物培养。

7.8.1.3将结果填入附表67.8.2HVAC状况监测7.8.2.1试验方法：7.8.2.2 将结果记录于附表77.9 物料转移7.9.1检查方法：①工器具、洁服处理后的转移：衣服、不锈钢桶、玻璃容器用棉球擦拭法在卸料、转移后取样作无菌检查。

用灭菌的生理盐水润湿棉球，充分擦拭，棉球取样面积为25cm2/ 个。

然后棉球放入带有灭菌的生理盐水的三角瓶中，充分振摇，然后进行微生物培养。

②灌装前药液的无菌转移：将注射用水从配料桶周转到配制罐，此时从配制罐内取水样，无菌培养。

然后由无菌区周转到十万级再由十万级周转到卡式瓶的无菌区，此时从配制罐内取水样，无菌培养。

具体详见《培养基模拟生产验证报告》。

③内包材的无菌转移：将灭菌后的底塞、卡式瓶在卸料、转移后取样作无菌检验，底塞外包装作擦拭试验。

④灌装用物料的无菌转移：输送药液所用硅胶管和灌装针头在卸料转移后取样作无菌检查。

用0.9%无菌氯化钠溶液100mL冲洗内壁，收集冲洗液，(注：用0.9%无菌氯化钠溶液100mL冲洗后的硅胶管和灌装针头，试验结束后再用注射用水冲洗。

)按无菌检查法中的薄膜过滤法检查。

7.9.2判断标准：各种物料在卸料后及转移后均应无菌。

按附表8 填写测试结果8玻瓶的处理：已灌装培养基的玻瓶在验证结束后全部销毁。

9缺欠项及纠正措施9.1目的建立缺欠项及采取的纠正措施，使验证规范化、标准化和程序化。

9.2内容9.2.1按附表9 格式总结缺欠项及纠正措施9.2.2按附表10 格式填写缺欠项纠正报告10验证结果评定与结论验证小组根据验证情况对验证结果进行综合评审，做出验证结论，按附表11 填写验证总结报告，由验证委员会做出是否批准的决定及负责发放验证证书(见附表12)。

a)验证试验是否有遗漏？b)验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因，依据以及是否经过批准？c)验证记录是否完整？d)验证试验结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明是否合理？是否需要进一步补充试验？验证方案变更申请及批准书附表 1验证方案名称：方案编号：验证方案预变更的项目：变更的理由及依据：修改后方案：评估变更后对验证的影响：□不会影响验证过程□ 影响验证过程□ 影响验证进度起草人/ 日期：部门经理/ 日期：变更的审批：□ 同意变更□ 不同意变更批准人/ 日期：培养基无菌性试验结果附表 2培养基生物生长性能试验结果附表3灌装培养结果附表 4判断标准：可信限在 95%的要求下，合格限：污染率应< 0.1%；警戒限 : >0.05% 计算公式：污染率 =95%可信限的控制上限 / 模拟分装的瓶数× 100% 结论：试验过程监测记录表附表 5设备设施表面的微生物数量附表 6期：HVAC监测记录附表 7-1尘埃粒子检测复核人/ 日期测试人/ 日期HVAC监测记录（空气沉降菌）物料转移无菌监测记录附表 8-1物料转移无菌监测记录表二附表 8-2缺欠项及纠正措施报告附表 9欠缺项纠正报告附表验证总结附表验证证书附表分装系统培养基分装验证记录：1.0 物料单:2.0 设备：3.0 器具：配料、灌装间的熏蒸消毒与监测：熏蒸用的溶液：体积：熏蒸前的室内温度：相对湿度：开始时间：结束时间：开万级空调时间：开百级时间：操作人：时间：复核人：时间：注：熏蒸消毒结束后、在分装前至少要监测2 天的静态环境，在分装过程中要监测动态的环境。

结果记录在制剂车间的环境监测表。

5.0 水质监测：确认纯化水检测是否合格□是□否确认注射水检测是否合格□是□否确认人：时间：6.0 培养基的配制和准备：6.1蒸馏水的称量：秤（天平）编号：水温℃（70℃以上）注入蒸馏水的50L 不锈钢桶总重为kg- 50L 不锈钢桶皮重kg= 所加蒸馏水重kg称量人：时间：复核人：时间：6.2培养基的称量：秤（天平）编号：倒入培养基后2L 烧杯总重为g ，- 2L 烧杯皮重g ，= 培养基净重为g 。

称量人：时间：复核人：时间：6.3将所称量的培养基缓慢倒入搅拌桶中，同时搅拌，待完全溶解后，停止搅拌。