2017/2/21第三章载体第一节基因克隆技术概述一、基因克隆技术基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
二、目的基因的取得1、直接2、反转录酶3、化学合成4、基因文库5、PCR♦首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。
将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。
这种方法也就是应用基因工程技术术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。
可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。
由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法。
三、重组体的构建1、载体要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体（Vector）。
（1）质粒（plasmid)（2）噬菌体λ的衍生物（3）科斯质粒（cosmid）（4）单链DNA噬菌体M13（5）病毒♦面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取，先用Eco RI把面包酵母DNA切成许多片段，使这些片段与λ载体连成重组DNA，可把这些重组DNA导入“吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型”大肠杆菌，在基本培养基中培养。
只有引入了该基因的细菌才能生长。
进一步分离这种菌株，可以得到目的基因。
2、载体的性质1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能力。
2）载体DNA的分子量应该较小。
3）载体上最好应具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性基因等），以赋予宿主细胞以不同的表型。
4）载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点；载体上的单一酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否已连接载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，利于筛选重组体。
3、酶系的选用四、转化及重组子筛选鉴定1、转化（transformation)获得重组DNA以后，必须将它导入宿主细胞中以扩增表达，这个导入宿主细胞的过程称为转化（transformation）感受态（competence)、电击2、重组子3、重组子的筛选方法（1）载体上的报告基因（reporter gene)抗药性基因、lacZ基因的显色反应、发光基因（lux)（2）单菌落扩增（3）菌落杂交一、质粒的概念附加体（整合质粒，intergrative plasmid)二、质粒的一般生物学特性1、质粒DNA（1）SC构型：共价闭合环形DNA(closed circle DNA, ccDNA)（2）OC构型开环DNA(opencircle DNA, ocDNA)（3）L型线性DNA(linker DNA, lDNA)2017/2/21第二节质粒载体（Plasmid Vector)质粒名称质粒来源核苷酸长度（kb ）分子量(MD)2、质粒的复制与遗传根据质粒与宿主菌的相关程度pTiAch5 土壤农杆菌213 142 某种质粒在一个细菌细胞内的数目就称为这种质To L 假单胞菌117 78 粒的拷贝数（copy number）F 大肠杆菌95 63严密型质粒（stringent plasmid)RP4 假单胞菌54 36Col E1 大肠杆菌 6.36 4.2 松弛型质粒 (relaxed plasmid)pBR322 大肠杆菌 4.362 2.9 根据质粒是否带有转移基因（tra基因）pBR345 大肠杆菌0.7 0.46 接合型质粒（传递性质粒）非接合型质粒22017/2/21严密型质粒（stringent plasmid)严密型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，复制与宿主菌密切相关，宿主菌内只有1-2个质粒拷贝存在，当宿主菌蛋白合成停止时，质粒的DNA复制也就随之停止松弛型质粒 (relaxed plasmid)松弛型质粒通常是分子量较小，不具传递能力的质粒，它在宿主菌内通常可含10-200个拷贝，而且不受宿主菌蛋白合成的影响，当宿主菌蛋白质合成停止时，例如当宿主菌遇上有抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素存在时，质粒DNA的复制仍可继续进行，甚至可将数十个增至几千个。
♦所谓质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象♦只有在确实证明第二种质粒B已经进入含有第一种质粒A的寄主细胞，而它的DNA并不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种质粒却不能长期稳定共存，在这种情况下，我们才能够说A和B是不亲和的质粒♦质粒不亲和的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。
♦接合型质粒又叫传递性质粒，接合型质粒可以从一个细胞自主地转移到原来不存在这种质粒的另一个细胞中去。
接合型质粒的分子比较大，编码一套控制质粒DNA转移的基因。
这一过程是由接合型质粒上的转移基因（tra genes）控制的。
♦非接合型质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自我转移。
根据质粒上带有特殊用途的基因♦ 1）生殖性质粒（fertility plasmid）这类质粒简称“F质粒”，它有tra基因，主要用于细胞间的接合生殖（F因子）♦ 2）抗性质粒（resistance plasmid）抗性质粒简称R质粒，它携带有赋予宿主细胞一种或多种抗生素抗性的基因，这些抗生素包括土霉素，氨苄霉素等。
（R因子）3）Col质粒Col质粒可以编码一种可杀死其他细菌的蛋白colicin。
♦4）降解质粒（degradative plasmid）降解质粒主要是使宿主细菌消化一些非“正常”的分子，如水杨酸等。
♦5）致病质粒（virulence plasmid）致病质粒赋予宿主细菌细胞以病原菌侵染性，例如土壤农杆菌中的Ti质粒（诱导肿瘤质粒，Tumor inducing plasmid）可以在大多数双子叶植物和少数单子叶植物上诱导形成冠瘿病。
♦ 3、构建质粒克隆载体的基本策略1）分子量尽可能小，多拷贝，而且便于提取和纯化。
分子量越小越能抵抗机械剪切力的切割，可容纳外源性DNA就越长。
分子量小的质粒往往属于松弛型质粒。
2）缺失tra基因，质粒就不会从一个细菌接触转移到另一个细菌，所以是非接合型质粒。
3）质粒序列中具有一个或多个单一的限制性内切酶位点。
4）具有一个或几个报告基因，而且引入的基因应在限制性内切酶的单切点之内，由于插入外源基因，这个报告基因灭活，从而便于筛选重组体。
3♦4、质粒的改造♦“天然质粒”:它一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体 外修饰改造的质粒。
♦在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有ColEI、RSF2124和pSC101 。
♦第一个用于基因克隆的是天然质粒pSC101，它对于Eco RI限制酶只有一个识别位点，而且在此克隆外源DNA既不会影响它的复制功能，也不会破坏其唯一的四环素抗性选择记号（Tet r）。
2017/2/21三、常用的质粒载体♦（一）pBR322质粒载体♦万能质粒之称♦1、标准的质粒载体命名法则“p”表示它是一种质粒“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F．Bolivar和R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母“322”系指实验编号“BR”恰好与“细菌抗药性”（bacterial resistance）两个词的第一个英语字母等同2、pBR322质粒载体的物理图谱3、pBR322质粒载体的构建♦ pBR322质粒的亲本之一是pMB1质粒。
复制子的来源。
♦ pBR322质粒上的氨苄青霉素抗性基因（Amp r）是取自于pSF2124质粒♦来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（Tet r）;♦在pBR322质粒载体的构建过程中的一个重要目标是缩小基因组的体积，这就需要从质粒DNA上移去一些对基因克隆载体无关紧要的DNA片段，同时也伴随着消除掉若干个对DNA克隆无用的限制酶识别位点。
还要设法使质粒内存在的任何易位子统统失去功能。
4、pBR322质粒载体的优点♦具有较小的分子量。
统一规定pBR322质粒DNA分子核苷酸的计数从Eco RⅠ限制酶的识别位点开始，并公认该序列--GAATTC--中的第一个T为核苷酸1。
♦克隆载体的分子大小最好不要超过10kb（6kb）。
♦具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。
因DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。
Amp s Tet s，Amp r Tet s， Amp s Tet r♦具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。
42017/2/21（二）pUC质粒载体♦1、概述♦在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）的lacZ’基因而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。
♦pUC，是因为它是由美国加利福尼亚大学（University of California）的科学家J．Messing 和J．Vieria于1987年首先构建的。
2、pUC质粒载体的结构（i）来自 pBR322质粒的复制起点（ori）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（Amp r），但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；（iii）大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的 DNA序列，此结构特称为lacZ’基因；（iv）位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。
3、pUC质粒载体的优点♦1、具有更小的分子量和更高的拷贝数在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多♦2、适用于组织化学方法检测重组体pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。
因此，在应用pUC8质粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定♦3、具有多克隆位点MCS区段（三）TA克隆载体♦ Taq DNA聚合酶具有一种非模板依赖性活性，这种活性可以在PCR产物的3’端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷（A）。
根据这一特点研制出了一种线性质粒，其5’端各带一个不配对的脱氧胸腺嘧啶核苷（T），采用该质粒可将PCR产物以TA连接的方式直接进行克隆，即TA克隆。