实验六培养基地制备和灭菌
一、目的要求
1、了解培养基地配制原理和方法，熟悉分离、培养微生物的有关准备工作。
2、了解几种灭菌方法，掌握加压蒸汽气菌原理及方法。
二、实验说明
培养基是用人工方法，将多种生物质按照微生物生长所需要而调制成的一种营养基质。
由于不同微生物营养类型不同，对营养物质的要求也不同，因此所需要培养基种类也不同。
培养基可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基三类。
根据是否有凝固剂及含有凝固剂的多少又可将培养基分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基。
凝固剂一般为琼脂（洋菜）也有用明胶等制成。
三、实验材料
1、高压蒸汽灭菌锅、天平、电炉、烧杯、试管、量筒、漏斗、玻棒、吸管、防水油纸、绳索、棉花、pH试纸等。
2、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、麦芽汁、磷酸氢二钾、硫酸镁、洋菜、马铃薯、蔗糖、可溶性淀粉、硫酸亚铁、1M盐酸液、1MNaOH 液等。
（一）配制培养基
培养基配制容器中先盛所需水量的一部分（蒸馏水或自来水，视实验要求而定），然后按培养基配方，称取各种原料，依次加入解，最后加足所需水量，如为蛋白胨、牛肉膏等物质，则需加热使之溶解。
在加热过程中所蒸发掉的水分，应待全部溶解后补足。
2、调节pH值用pH试纸或其他方法测定pH值，以1M的NaOH 或1M的HC1调节至所需要的pH调节至所需要的pH值。
3、溶化凝固剂如制备固体培养基，应先将琼脂称好洗净，煮沸已配好的液体培养基，在沸腾状态下将琼脂加入，并不断撑拌直至完全溶解为止。
加热水补足所蒸发的水分。
过滤或不过滤（视需要而定）。
4、培养基分装将已过滤好的增基分别按需要分装于锥形瓶或试管内。
分装方法（图6-1）。
注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸润棉塞引起杂菌污染。
装入试管的培养基量，视试管大小及需要而定，一般制成斜面培养基时，每支小试管（15×150mm）约装4-5ml（1/4-4/5试管高度）如制深层培养基时，每支试管（20×220mm）约装12-15ml即可。
分装后，塞上棉塞，包上防水纸，然后进行高压灭菌。
按上述步骤分别配制下列培养基：
（1）牛肉膏白胨培养基
（2）淀粉培养基
（3）麦芽汁培养基
（4）马铃薯培养基
（二）培养基和玻璃器材的灭菌方法
常用的灭菌（消毒）的方法，通常可分为四大类：（1）加热灭菌（包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮佛消毒）；（2）过滤除菌；（3）射线灭菌和消毒；（4）化学药剂灭菌和消
毒。
在本次实验中只介绍与培养基有关的灭菌方法。
1、干热灭菌法（即热空气灭菌法）干热灭菌一般是利用电热烘箱作为干热灭菌器。
所使用的玻璃仪如试管、三角瓶、培养皿等要用干热灭菌。
灭菌之前要做棉塞或包上牛皮纸（或旧报纸）。
打开烘箱顶部的通气孔，接上电源加热，使箱内温度达到160℃关闭通气孔，保持1-1.5小时。
待温度下降至60-70℃以下，方可打开箱门取灭菌物器，否则骤冷后易使箱内玻璃器皿破损。
2、加压蒸汽灭菌法加压蒸汽灭菌是利用高压灭菌器，使水的沸点在密封的灭菌器内随压力升高而增高来提高蒸气的温度和灭菌的效率的。
高压灭菌器的主要构成部分是：灭菌锅、盖、压力表、放气阀、安全阀等。
加压蒸气灭菌操作过程如下：
（1）加水在灭菌器内加入一定量的水。
（2）装料将待灭菌的物品放在灭菌桶内。
包与包之间留有适当的空隙以利蒸气的流通。
（3）密封将盖上软管插入灭菌桶的槽内，上下对齐，拧紧螺栓，切勿漏气。
（4）升压点燃煤气或接通电源，加热至水沸腾，打开排气阀，排气数分钟，关闭排气阀，升压。
（5）灭菌待压力达到一定时，开始计算灭菌时间，同时应减弱加热使其恒压。
（6）降压达到规定的灭菌时间后，关闭煤气或电源，让其自
然降压冷却。
（7）取料待压力降至零时，打开排气阀，然后打开灭菌器盖子，取出物品。
如需制斜面应趁热摆好（图6-2）。
（8）倒水灭菌锅用好后，将锅内剩余水倒掉，以免日久腐蚀。
（9）将灭菌后的培养基置于37℃恒温箱中24h，作无菌培养。
若无菌生长，可保存备用。
3、间歇灭菌法用阿诺德（Arnold）灭菌器或蒸笼灭菌。
此种方法在常压条件下进行灭菌，故蒸气温度不超过100℃。
适用于没有高压灭菌设备或不适于加压灭菌的物品。
做法是：
（1）将欲灭菌的物器放入灭菌锅或蒸笼内每天蒸煮一次，每次半小时，连续蒸煮三次。
（2）在两次蒸煮之间，将培养基放在28-30℃恒温条件下培养。
这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发为营养体，于下次蒸煮时杀死。
4、过滤除菌法对某些不耐热的液体物质（如抗生素、维生素或血清），可用过滤的方法来除菌。
（1）过滤除菌法系采用特殊的细菌过滤器（图6-3）来进行。
细菌过滤器中的过滤板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，过滤板的眼孔很小，细菌不能通过，因此过滤后的液体就无菌体了。
（2）在进行过滤除菌前，先将整个过滤器和接受器皿装置好后，须经高压蒸气灭菌。
五、实验作业
1、你做的培养基是否有异常现象？试分析原因。
2、配制固体培养基加琼脂后加热融化时注意哪些问题？如何检查培养基灭菌是否彻底？
3、培养不同微生物为什么要采用不同种类的培养基？。