mRNA
逆转录酶的 DNA聚合酶
互补DNA
DNA 聚合 酶
逆转录酶的 RNase H
分解mRNA
第二条CDNA链
RNA探针
1、RNA探针是单链分子，与靶序列的杂交反应效率高。 2、早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探 针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中 得到标记的，标记效率不高，且受到多种因素的制 约。 3、体外逆转录可高效合成RNA，加入标记物可成为探 针 4、应用：例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病 毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利 用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地 筛选到多株HIV基因组DNA克隆。
（3）标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成
代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新
合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，
3H-尿苷可掺入到RNA中
体外标记法：
化学标记法：标记物分子上的活性基团与
探针分子上的某些基团反应，
标记物直接结合到探针分子上
酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上
随机引物法
其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，
作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下， 按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与 模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成 一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性
核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中
随机引物法所具有的优点：
4、待测样品为总RNA或mRNA
Northern印迹与Southern 印迹的不同点
1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保
持RNA处于变性膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA
三、 核酸分子杂交的方法 按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
• 固-液相杂交
膜上印迹杂交
原位杂交
• 液相杂交
RNA酶保护分析法
核酸酶S1保护分析法
限制性酶切割
限制片段 琼脂糖电泳
DNA分子
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶 滤膜
转膜 吸附有DNA 片段的膜
寡核苷酸探针
利用寡核苷酸自动合成仪，可很简单地合成制 备寡核苷酸探针(如15～50bp)， 寡核苷酸探针的优点： ①短的探针比长探针杂交速度快，特异性强。 ②可以在短时间内大量制备。 ③在合成中进行标记制成探针。 ④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂 交中自我复性，提高杂交效率。 ⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段 。
3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂 交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进 行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交 液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶 液在68℃杂交
• 对酶促反应活性无影响或影响不大
• 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
（3）标记物种类 • 核素标记物：32p、35s、3H • 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光
同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此
法则是利用离心的方式来纯化探针
二、影响杂交的因素
1、核酸分子的浓度和长度：
浓度越大，复性速度越快
分子越大，复性速度越慢
单链探针，浓度增加，杂交效率增加
双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂
交效率
2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃ （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
（二）探针的标记 1、理想标记物应具备的特性：
• 高度灵敏性
• 不影响碱基配对的特异性
• 不影响探针分子的主要理化性质
• 对酶促反应活性无影响或影响不大
• 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
2、标记物 （ 1） 理想标记物应具备的特性：
• 高度灵敏性
• 不影响碱基配对的特异性
• 不影响探针分子的主要理化性质
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程
（一）Southern印迹杂交 1、待测核酸样品的制备 （1）裂解或破碎细胞 （2）抽取纯化基因组DNA （3）限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
2、待测DNA样品的电泳分离 （1）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶
分离小片段用高浓度胶
（ 2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子
（2）比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针
7、Southern杂交的应用 （1）酶切图谱分析 （ 2）特定基因定性和定量
（3）基因突变分析
（ 4）限制性片段长度多态性的分析
（二）Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA
3、探针可用DNA或RNA片段
Southern印迹的常用方法
（1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中
的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬
酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤
纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，
同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝
DNA探针的主要优点
①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖， 取之不尽，制备方法简便。
②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有 效抑制DNA酶活性。 ③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选 择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等， 能用于同位素和非同位素标记
cDNA探针
cDNA（complementary DNA）是指互补于mRNA 的DNA分子。

变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
二、核酸分子杂交的 探针
（一）探针的种类
1、根据组成分类 • 基因组DNA探针
• cDNA探针
• RNA探针
• 寡核苷酸探针
2、标记物
放射性同位素标记法 35S
如32P、3H、
非放射性同位素标记法 如金属、半抗原、 荧光素
3、标记的方式 体内标记法 体外标记法
1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记 2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不 当所带来的一系列问题 3、标记活性高，标记活性可达108cpm/µ gDNA以 上 4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记
PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反
应的底物，以待标记的DNA为模板，经
DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，
大小 相同的分子处于同一条带 （ 3）分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂 所用分子量标准可用核素标记
3、凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液
4、Southern印迹
指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固
相支持物上的过程。
（1）固相支持物的选择 理想的固相支持物应具备的特性： ①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固
④具有良好的机械性能
非特异吸附少
常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分
子中
（三）探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可
去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将
大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷
酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用
• 不改变核酸在组织细胞内的定位
• 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
（2）组织细胞杂交前的预处理
• 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上
。
（2）电转法
利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相 支持物上。
（3）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤
膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真 空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层 容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中， 同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜
5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序 的总长度 （2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比
（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性
6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分 子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉