最基本的原则是核酸探针与要检测的核酸之 间在核酸序列上要有高度的特异性
基因组DNA探针
• 真核生物基因组中存在大量的重复序列和 非编码序列，因此选择基因组DNA做探针 时，一定要充分考虑实验目的性
• 利用分子克隆或PCR方法可以获得某一段 特定的DNA序列
cDNA探针
• cDNA是能与mRNA互补的DNA分子，它是 利用RNA分子作模板在逆转录酶作用下产 生的。
复性
RNA
DNA
1. 原理 DNA的变性与复性
2. 常见条件：加热 S形曲线 解链温度（Tm） A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在
亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
• 化学法P48：利用标记物分子上的活性基团与探 针分子上的基团发生的化学反应直接将标记物结 合到探针分子上。特点是简单、快速、均匀。
• 酶法P48：将标记物预先标记在核苷酸分子上， 然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子渗入到探 针分子上去，或将核苷酸分子上的标记基团交换 到探针分子上。
一个理想的标记物应满足：
(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。
常用探针的标记方法
3.2.1 缺口平移法 3.2.2 随机引物标记法 3.2.3 末端标记法 3.2.4 生物素光照标记法
缺口平移法的原理
• 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相结合。
第二节 核酸探针技术及其标记
探针 (probe) P46 经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，
能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检 测核酸样品中的特定基因。
一、核酸探针的种类和应用
根据核酸性质和检测目的不同可以分为： （一）基因组DNA探针 （二）cDNA探针 （三）RNA探针 （四）人工合成的寡核苷酸探针
第七章 核酸分子杂交技术与核酸
序列测定
Molecular Hybridization and Blotting Technology
Content of Table
前言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术
前言
核酸分子杂交
把亲源关系较近的，不同生物个体来源的 变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA 或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
在适当条件下，变性DNA的两条互补链 可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(ann酸分子杂交的应用
研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础
• 首先用E.coli的DNAse I 在探针DNA双链上造成缺口， 然后再借助于DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物 素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。
• 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链 上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的 DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。
随机引物标记法原理
用一些六核苷酸作为随机引物，将这些 引物和探针DNA片段一起热变性，退火后， 引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的 作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新 的标记的探针片段。
• 利用DNA合成仪，采用化学方法人工合成 寡核苷酸探针
设计寡核苷酸探针的原则
• 1）序列及长度 根据靶分子的序列而定， 长度一般为18-50个核苷酸合适。
• 2）碱基成分 一般G+C含量为40%-60% • 3）探针分子内不存在互补，避免出现“发
夹”结构 • 4）避免单一碱基的重复出现，不超过4个 • 5）与非靶标区域的同源性不超过70%
二、探针的标记
• 探针标记方法: 放射性和非放射性两种
放射性核素： 32P、35S和3H 非放射性标记物： 1）半抗原：生物素、地高辛素 抗原-抗体反应 2）配体：生物素-亲和素反应 3）荧光素 (FITC、罗丹明) 4）化学发光探针
探针标记方法
• 核酸分子杂交所用的探针几乎都用体外标记法标 记，分为化学法和酶法
第一节 核酸分子杂交的
基本原理
一、分子杂交与印迹技术的原理P44
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单
链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放 在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间 有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分 子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
• 利用基因克隆的方法可获得cDNA • 优点：cDNA探针不含有内含子序列，尤其
适用于基因表达的检测。
RNA探针
• RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交 反应效率极高
• 早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和 病毒RNA探针。利用mRNA与基因的 DNA 杂交，可以反映出基因的转录状态。
人工合成的寡核苷酸探针
➢ Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成， 在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的 50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解 温 度 (melting temperature, Tm) 。 其 大 小 与 G+C含量成正比。
DNA的复性与分子杂交
DNA复性(renaturation)的定义
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱 ➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
热变性
➢解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以
温 度 对 A260 （ absorbance ， A ， A260 代 表 溶 液 在 260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解 链曲线。