DNA片段复杂性
合适的复性温度 适当的离子强度
重点提示
分子杂交：指具有一定同源序列的
两条核酸单链（DNA或RNA），在 一定条件下按碱基互补配对原则经 过退火处理，形成异质双链的过程。 利用这一原理，就可以使用已知序 列的单链核酸片段作为探针，去查 找各种不同来源的基因组DNA分子
中的同源基因或同源序列。
核酸分子杂交 (molecular hybridization of nucleic acid)
核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条 件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双 链杂交体的过程。 核酸分子杂交技术：利用核酸分子杂交检测 靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。 核酸分子杂交技术目前应用广泛，是定性或 定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
杂交的特异性。
（二）探针的长度
1.DNA和RNA探针 DNA探针通常为400～500个碱基 2. 寡核苷酸探针 探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性
（三）核酸探针的标记
1. 探针标记物的选择
（1）放射性标记 （2）非放射性标记 根据标记物掺入情况可分为均匀标记和 末端标记探针。
不同标记类型探针的比较：
一、核酸探针
核酸探针指能与靶核酸序列发生 碱基互补杂交，并能由其标记被特异 性检测的核酸分子。
（一）常用探针的种类
寡核苷酸探针
DNA探针
探针的种类 RNA探针
基因组DNA探针
cDNA探针
1. DNA探针 最常用的核酸探针 三大优点：
① 这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制备 方法简便； ② DNA探针相对不易被降解，一般DNA酶活性能有效地
32P-标记的DNA
切口最终位置
(3) DNA的末端标记
1) DNA的5′末端标记
条件是有5’-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链 DNA需用碱性磷酸酶切除5’-P后再标记 5′p-HO-CpGpTpA……3′ 碱性磷酸酶
5′HO-CpGpTpA……3′
T4噬菌体多核苷酸激酶 [γ -32P]-ATP
（1）DNA随机引物标记
随机引物：含有各种可 能排列顺序的寡核苷酸 片段的混合物。
DNA聚合酶ⅠKlenow片段： 保留 5’→3’DNA聚合酶 活性 , 弱 3’→5’外切酶 活 性 ， 无 5’→3’ 外 切 酶活性。
（2）DNA切口平移标记
5′ 3′
DNase I，Mg2+
dATP，dGTP， dTTP
G-C含量越多 A-T含量越多 Tm值越高 Tm值越低
（2）溶液的离子强度
低离子强度 高离子强度 Tm值越低 Tm值越高
（3）pH值
pH值5-9 pH<4, pH>11 Tm值变化不明显 不利于氢键形成
（4）变性剂
干扰碱基堆积力和氢键的形成
3.复性 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。 影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小
2.探针标记方法的选择 制备探针步骤：
探针标记
清除未标记的核酸探针 检测探针标记效率
核酸探针的标记方法
(1) DNA切口平移标记法 (2) DNA随机引物标记法 (3) DNA的末端标记 (4) cDNA探针的标记 (5) 寡核苷酸探针的标记 (6) 单链DNA探针的标记 (7) RNA探针的标记
第四章
核酸杂交技术
目 录
第一节 核酸分子杂交的概念
一、核酸探针
二、分子杂交信号检测
第二节 经典的核酸分子杂交技术
一、固相杂交
二、液相杂交
目 录
第四节 影响杂交信号检测的因素
一、探针的选择
二、探针的标记方法
三、探针的浓度 四、杂交率 五、杂交温度 六、杂交的严格谨性 七、杂交反应时间 八、杂交促进剂
第一节
核酸分子杂交的概念
变性
退火
复性
核酸分子杂交的基本原理
1、变性（denaturation）
定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，
形成无规则线团，双链解链成为单链。
2、融解温度 (Melting Temperature, Tm)
定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。 影响Tm的因素： （1）DNA碱基的组成
被抑制；
③ DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择， 如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等，能用于 放射性核素和非放射性物质标记。
2.RNA探针
• 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少，未杂交探针可用RNase 降解， 减少本底的干扰。 • 缺点：易降解，标记方法复杂 。
3.寡核苷酸探针 寡核苷酸探针一般由17～50个核苷酸组成。 优势：可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列； 缺陷：寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定， 需优化杂交和洗脱条件以保证寡核苷酸探针
二、分子杂交信号检测
（一）放射性标记探针检测 1、放射自显影 2、液体闪烁计数法 （二）非放射性标记探针的杂交检测 1、酶促显色检测 2、荧光检测 3、化学发光检测 4、多探针检测
优点 缺点
可以准确定量；灵 放射性探 敏度高；本底低； 易于除去旧探针, 针 重新杂交新探针 对人体危害小；稳 非放射性 定，可供长时间内 持续使用；检测过 探针 程快；可同时进行 不同标记探针的杂 交；本底较低
短半衰期的探针需临用 前制备；放射性递减使 探针降解；放射性物质 对人体有害；费用贵 灵敏度不如放射性探针； 杂交条件受报告基团的 限制；重新杂交新探针 比较困难
DNA聚合酶I [α-32P]-dCTP
3′ 5′ DNA 酶 Ⅰ ： 在 双 链 DNA 上 随 机 打开 若 干 个单 链 缺 口 ， 产 生 3’-OH 端。 大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ ： 5’→3’DNA 聚 合 酶 活 性 ； 5’→3’ 外 切 核酸酶活性。
32P-部分标记的
变性
单链DNA片段 切口原始位置
5′32p-O-CpGpTpA……3′
37℃，反应10min, γ -32P-ATP 需150 μ ci/反应
2)
5′ 3′
DNA的3′末端标记
3′ 5′ 限制性内切酶 3′ 完整双链DNA
5′
5′ 3′
5′
3′
5′末端突出的 3′ 5′ DNA Klenow DNA聚合酶 [α -32P]-dNTP 其他3 种dNTP 3′ 3′末端标记的 5′ DNA 变性 3′ 32P-末端标记的 5′ 单链DNA探针