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二、片段连接与融合
1.1 基本原理
连接 与受体结合的相邻的两个片断经连接基 连接成活性强的较大分子
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二、片段连接与融合
1.1 基本原理
融合 与受体结合的相互交盖或接近的两个片 断合并成活性强的较大分子
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三、片段自组装
1.1 基本原理
分别结合在活性位点中相邻口袋的两个活性片 段含有可相互反应的基团，这两个片段可自发 地反应连接成为高活性的化合物。靶蛋白在整
候选药物 HTS 苗头物 药物
uM
nM
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生物活性
第二节 活性片段的检测技术
一、磁共振技术
基本原理
配体与生物大分子结合后，许多NMR参数(化 学位移δ)会发生改变，通过检测并分析这些数
据，可以来判定配体是否与受体结合、结合的
强弱以及结合模式。
分类
检测配体的筛选 LDBS 检测受体的筛选 TDBS
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1. 检测配体的筛选 LDBS
1.1 原理
弛豫时间长短与分子大小成反比，小分子化合
物的弛豫时间长，大分子靶蛋白的弛豫时间短。
当药物与靶蛋白结合后就变成大分子，弛豫时
间变短。 只要适度延迟回复能量检测时间，就可以做到
只检测到游离小分子药物，而检测不到大分子
靶蛋白及其与小分子化合物的复合物。
3.1 原理
I. 通过二维15N-HSQC谱中15N或1H的化学位移变化
来检测是否有小分子与靶蛋白结合。
II. 配体和蛋白结合常数可通过化学位移的变化和配
体浓度关系测得。 III. 筛选得到结合于靶分子活性位点亚区域的低亲和
性配体，将这些配体连接可以得到具有较高亲和
力的配体。
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3. 磁共振构效关系研究法 SAR-by-NMR
I. 考察靶蛋白活性口袋附近是否含有内源性半胱氨 酸残基，如果没有，则采用定点突变引入半胱氨 酸残基。 II. 将片段库中的片段都连上相同的巯基侧链，将靶
蛋白臵入片段的高浓度溶液中。在溶液中片段和
靶蛋白的二硫键的形成和解离达到动态平衡。 III. 片段和靶蛋白结合不仅能形成二硫键，而且片段 还会与附近的活性口袋结合，从而形成更稳定的 片段-靶蛋白共价复合物。
这种方法得到片段与报告配体结合到药靶相同区
域，避免检测到与药靶非功能区域结合的片段， 有效降低假阳性。
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2. 检测受体的筛选 TDBS
2.1 先决条件
I. 已知靶蛋白的结构
II. 对靶蛋白进行15N标记
2.2 原理
当小分子与靶蛋白结合后，会改变结合位点局部
的化学环境，通过15N标记蛋白的二维15N-HSQC
片段自组装 fragment self-assembly
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一、片段生长法
1.1 基本原理
以受体结合的第一个片断为核心，经过理性设
计，在邻近处逐渐生长成活性强的较大分子
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1.2 实例—Plexxikon发现PPAR激动剂indeglitazar
Dean R. Artis, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2009, 106(1): 262-7.
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2. 共价结合—Tether方法 2.5 二次Tether技术
原理 用一个已知活性片段对靶蛋白进行共价修饰， 然后将片段潜在的另一个巯基游离出来，用Tether 方法去结合新的片段。 已知活性片段
具有亲电的特征(例如含有易离去基团)；
含有一个潜在的巯基(如硫酯)
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2.6 实例—采用二次Tether方法发现高效caspase-3 抑制剂
2. 发现新药可行性高
将高通量筛选得到的先导物优化为候选药物，既
要使活性有较大幅度提高，又要保持分子量基本 不变，难度较大。 而从片段优化至候选药物，分子量和活性同步增 长，更加符合新药发现的一般规律，可行性更强。
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二、基于片段分子设计的优点
700
600
相 对 分 子 质 量
500 400 300 200 100 0 mM 片断
9
二、研究方法
3. 结构信息的确定
确定片段与药靶结合的结构信息对于指导片段转 化为先导化合物起至关重要的作用。
磁共振、质谱、X-射线单晶衍射
4. 基于片段构建新分子
基于片段药物设计的最终目标就是要发现先导化
合物甚至是候选药物。 利用药靶活性位点与片段相互作用的结构信息， 在片段基础上进一步设计新的分子。
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2. 共价结合—Tether方法 2.3 优点
I. 片段和药靶之间形成了稳定并且可逆的二硫键。 用质谱快速检测得到与药靶具有较好契合的片段， 降低假阳性率。 II. 可精确定位片段在药靶活性位点的位臵。
2.4 缺点
I. 需要采用定点突变技术在药靶活性位点引入半胱 氨酸残基。 II. 片段库中，商业化的二硫键片段很少，需自行合 成，增加了实验的难度。
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二、研究方法
基于片段的药物设计分为三个阶段
I. 片段筛选。采用灵敏的检测技术筛选片段库，
发现能与药靶结合的片段。结合力较弱，一般 为mM级。
II. 确定片段与药靶结合的结构信息。考察片段与
药靶结合区域以及如何相互作用。
III. 根据片段与药靶相互作用的结构信息来指导对
片段进行优化或衍生化，或将作用于不同口袋 的片段连接，构建新分子。
3.2 实例—Stuker发现FK506蛋白抑制剂
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二、质谱技术
1. 非共价结合—电喷雾质谱 ESI 1.1 原理
将片段与靶蛋白配成混合液，设定合适的离子 化条件，将片段-靶蛋白复合物由液相转化为 气相，测定荷质比(m/z)，从而得到结合片段
的分子量，进而确定是哪一个片段与药靶结合。
继续运用色谱技术分离得到片段-靶蛋白复合 物，并将片段解离，通过测定浓度，计算得到 亲和力。
命中化合物的类药性较差。化合物分子量比较
大，亲脂性强，优化成药的难度大。
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III. 许多药靶的活性位点是由多个口袋组成。高通量 筛选的化合物过于“成熟”，通常不能与靶蛋白 很好地结合，而对于其中单个片段的优化往往会 影响整个分子，甚至导致结合位臵的改变。
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IV. 苗头化合物(hit)多以活性强度为衡量标准。hitto-lead和先导物优化，大都加入或变换基团，以
谱图，可以找到各酰胺信号15N或1H的化学位移 变化。
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2. 检测受体的筛选 TDBS
2.3 优点
I. 不仅可以检测是否结合，还可以检测结合位点。
II. 准确度高，特异性强。
2.4 缺点
I. 仅适于分子量小于40000的靶蛋白；
II. 需进行15N标记，而且能制备200 mg以上的量 。
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3. 磁共振构效关系研究法 SAR-by-NMR
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2. 共价结合—Tether方法 2.2 操作
IV. 溶液中活性片段-靶蛋白复合物的浓度远高于其他 复合物，在质谱图上可以轻易识别出活性片段。 根据插入半胱氨酸残基位臵的不同，还可以判断 结合位臵。
V. 通过二次Tether技术可以筛选得到相邻位点的活
性片段。然后将两个片段以合适的连接子连接， 得到高活性化合物。
个过程中起催化作用。
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1.2 实例—乙酰胆碱酯酶抑制剂的设计
1.2 实例—神经氨酸酶抑制剂的设计
I. 不能获得靶蛋白结合位点的信息以及片段在结
合位点的取向。
II. 受配体溶解性限制，存在非特异性结合的假阳
性问题。
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1. 检测配体的筛选 LDBS
1.4 修正—报告配体筛选方法
操作
I. 在筛选样品中加入一个已知能与药靶某一区域
具有弱结合的分子，称为报告配体或者探针。
II. 片段分子可竞争性地与报告配体结合药靶，亲 和力高于报告配体的片段分子被检测出来。
增加与靶标结合的机会和强度。一般“不敢”
轻易去除基团或片断，以免丢失参与结合的原 子或基团(即药效团)。 V. 公司之间的化合物的结构类型相似，筛选靶标 相同，易有知识产权纠葛。
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2. 应对策略—基于片段的药物设计
设计理念
药靶的活性位点是由多个口袋组成；
寻找能与药靶各个口袋特异性结合的片段； 将上述各个片段用合适的连接子连接起来，组成 高活性的化合物。将片段连接后会引起结合自由 能跳跃式下降，从而导致亲和力大幅度提高。 是一种将随机筛选和基于结 Nhomakorabea的药物设
计结合的药物发现新方法。
首先筛选得到低分子量和低亲和力的片
段，然后基于药靶结构信息将片段进行 优化或连接，得到与药靶亲和力高且类 药性强的新分子。
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第一节 基于片段的分子设计原理
一、发展历程和基本理论
1.发展背景—高通量筛选的缺陷
I. 盲目性大，命中率很低。理论计算，含有30个 重原子的化合物有1060种，而高通量筛选的化合 物数即使以百万计(106)，筛选也只占很少部分。 II. 对于部分药物靶点很难筛选得到理想的化合物，
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1. 非共价结合—电喷雾质谱 ESI 1.2 实例—发现细菌U1061A功能域配体
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二、质谱技术
2. 共价结合—Tether方法 2.1 原理
靶蛋白的半胱氨酸残基巯基与连有二硫键侧链 片段形成新的二硫键。 含二硫键片段组成：片段母体、连接基团、离
去基团(2-巯基乙胺)。
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2. 共价结合—Tether方法 2.2 操作
第十一章 基于片段的药物分子设计 Fragment-Based Drug Design
内容提要
第一节 基于片段的分子设计原理 第二节 活性片段的检测技术 磁共振技术 质谱技术