（一）直接显微镜检查——染色标本
染色标本目的：了解细菌的形态、染色性或观察宿主 细胞内包涵体。
方法：革兰染色、墨汁染色、抗酸染色、荧光染色
G-R
革兰染色 阴 性 杆 菌
阳性球菌（G＋S） 真菌孢子
细菌的形态、染色性的特征
墨汁染色
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ宽厚荚膜
•荚膜抗吞噬 •30%-50%的患者伴有免疫功能低下等 疾病， 8%左右的AIDS患者伴有隐球菌 性脑膜炎，预后极差。 •中枢神经系统存活与脑脊液中缺乏抗体 和补体激活系统有关 •抗真菌治疗:两性霉素B,氟康唑
采集时间：一般在抗生素使用前， 于发热初期或高峰期采血。
采集频率：24小时内采血2~3 次可提高阳性率，且在不同部位。
采血量：血液与培养基的比例为 1：5-10，一般成人血量 5~10ml，婴儿1-5ml。
（二）尿液标本的采集
首次晨尿，无菌采集中段尿 10-20ml。
排尿困难者考虑导尿采集标本。 如考虑厌氧菌感染，采取膀胱
第九章 临床病原体检测
提纲
第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法
第二节：病原体耐药性检测 第三节：临床感染常见病原体检测
药敏检测
第四节：病毒性肝炎检测 第五节：性传播疾病病原体检测
病原体检测
第六节：医院感染常见病原体检测
教学目的与要求：
了解掌握临床病原体检查的主要内容（标本采集、 标本验收、药敏检查、耐药性检测、临床常见病 原体、病毒性肝炎、性传播疾病、医院感染） 、检测原理以及临床实际应用的重要意义。
穿刺法采集标本。
标本送检
标本要求尽快送检，否则影响阳性率。 烈性传染病标本需专人护送。
二、标本的实验室质量评估标准
1．标本必须注明姓名、年龄、性别、采集日期、临床诊断、检 验项目等基本信自。 2．仔细核对标本采集日期和送检日期。延误的标本，一般情况 下不接收。通常用于细菌学检验的标本的存放不要超过24h。而 病毒检测的标本可于4℃存放2～3天。 3．检查送检容器是否完整，有无破损或渗漏等情况，若有则不 予接收。 4．标本储存、运送方式不当，不予接收。
A、B
中间型
彦岛型
A、B、C
颗粒 凝集
利用抗原抗体之间的特异性反应，用 已知抗体检测患者血清及其他体液中 的待测抗原
检测细菌不同的抗原构造， 还可分析细菌的菌群和血清型， 如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属
（三）病原体核酸的检测
常用试验方法有： 1. PCR。polymerase chain reaction聚合酶
PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理

Taq
PPCCRR反过应程条件957502℃
PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理

PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
第第12轮轮P扩扩C增增R的基本原理
第3轮扩增PCR反应条件
PCR过程 PCR的特点
（四）病原体的分离培养和鉴定
2.不能人工培养的病原体感染性疾病
将标本接种易感动物、鸡胚或行细胞培养
（五）血清学试验
用已知病原体的抗原检测 患者血清中相应抗体以诊 断感染性疾病。
人体感染病原体后经过一定 时间产生特异性抗体，在体 内可维持数月或更长时间。
双份血清检查：病程早期和晚期分别采血 清2-3份检查，双份血清的滴度呈4倍或4 倍以上升高，考虑病原体感染
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
重点与难点
标本采集的原则及各种检查方法的适用范围及其优缺点 药物敏感的常用试验方法及其特点 耐药菌检测试验 各种类型临床常见病原体的检查 甲、乙、丙型肝炎的检测方法 各种性传播疾病病原体的检测方法、筛选试验、确诊试
验及金标准 院内感染定义
提纲
第一节：标本的采集运送、实验室评价和检查方法 第二节：病原体耐药性检测 第三节：临床感染常见病原体检测 第四节：病毒性肝炎检测 第五节：性传播疾病病原体检测 第六节：医院感染常见病原体检测
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
引物2
DNA引物

PPCCRR反过应程条件9550℃
PCR的特点
引物1
PCR的基本原理

PPCCRR反过应程条件5702℃
PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理

PPCCRR反过应程条件7925℃
临床细菌学检验的特殊性
依赖于细菌生长 采集时间 （发烧？） 运送方式 （密闭与否，保温与否？） 感染的细菌种类及生长特征 （苛养菌） 病人是否使用抗生素 （抗生素的影响） 其他：消毒剂，白细胞吞噬等
容易受环境中的细菌污染 采集方法 （无菌操作，避免污染） 放置时间 （及时运送，避免细菌死亡）
三、检查方法
（一）直接显微镜检查 （二）病原体特异性抗原检查 （三）病原体核酸检查 （四）病原体的分离培养和鉴定 （五）血清学试验
（一）直接显微镜检查——不染色标本
不染色标本：适用于检查 生活状态下病原体的动力 及运动状况。
方法：压滴法、悬滴法。 意义：在不染色状态下借
助暗视野显微镜或相差显 微镜观察病原菌的动力、 活动方式。部分病原体可 借此初步诊断，如梅毒螺 旋体。
第4轮扩增第5轮扩增
第6轮扩增
PCR扩增产物电泳
PCR技术的特点
1 ）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍
30轮循环
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水 平
能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU
2 ）特异性
引物 引物
分离培养是微生物学检验中确诊的关键步骤
根据临床症状、体征和镜下检查特征做出病原学初 步诊断，选择最合适的培养方法，主要是选择适当 的培养基、接种前的标本处理和确定孵育条件，然 后根据菌落性状(大小、色泽、气味、边缘、光滑 度、色素、溶血情况等)和细菌的形态、染色性， 检测细菌生化反应结果和血清学实验、动物接种实 验(白喉杆菌)，对分离菌作出鉴定，也可借助于微 量鉴定系统快速简便鉴定分离菌
• 法医
– 犯罪现场标本分析
• 肿瘤
– 各种肿瘤检测
• 其他……
（三）病原体核酸的检测——PCR
PCR：一种体外基因扩 增技术，对目的基因组 DNA的信号进行放大。
（三）病原体核酸的检测——Realtime PCR
实时荧光定量PCR：通过 起始点定量和荧光检测系 统实时监测累积荧光强度 而实现核酸定量的一种技 术。
一、标本采集和运送
基本原则
1：正确的标本类型和采集部位以反映有效病程 2：采集和运送应无菌操作，避免污染 3：尽快送检 4：视所有标本为传染品，高度污染标本要有明显标 5：注意生物安全，标本用后要做消毒处理
（一）血液标本的采集
适应症：疑似菌血症、败血症或 脓毒血症的病人
酒精棉球消毒，防止污染。静脉 采血后，将血液注入培养瓶内 。
标本中如果存在多种正常寄居微生物，可因交叉抗原 存在而不能肯定诊断。
检测细菌不同的抗原构造，还可分析细菌的菌群和血 清型，如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属等
细菌的血清分型： O1群霍乱弧菌的菌体抗原由A、B、C三个抗原 成份组成
O1群霍乱弧菌的血清分型
型别
别名
O抗原成份
原型
稻叶型
A、C
异型
小川型
电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值
电子显微镜发现为 某种冠状病毒
电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值
意义
1. 无菌体液的直接镜检对病原体诊断具有一定意 义。
2. 对正常菌群寄居腔道的分泌物图片镜检可提示 进一步检查的步骤、采取的方法和确定分离鉴 定病原体所需的培养基。
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理

PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
广泛应用于结核和麻风分 枝杆菌、乙型肝炎病毒、 丙型和戊型肝炎病毒、 HIV、巨细胞病毒的检查
（三）病原体核酸的检测——Realtime PCR
（三）病原体核酸的检测——基因芯片
将大量核酸片段(寡核苷酸、PNA、cDNA、基因 组DNA)以预先设计的方式固定在载玻片、尼龙膜 和纤维素膜等载体上组成密集分子阵列，与荧光素 或其他方式标记的样品进行杂交，通过检测杂交信 号的强弱进而判断样品中靶分子的有无和数量。该 技术具有高通量、自动化程度高、快速、样品用量 少、灵敏度高、特异性强、污染少等特点。病原微 生物的16S rDNA及23S rDNA序列近几年被作 为一个较理想的基因分类靶序列，其在进化压力下 保持了高度的保守性，同时又具有一定的变异性， 基因芯片技术通常利用病原微生物的这一分子生物 学特性，实现多样本多病原微生物的同时检测。