狂犬病的流行病学及其诊断孙泉云(上海市畜牧兽医站 201103) 潘水春(上海市南汇区畜牧兽医站 201300)狂犬病是由狂犬病病毒所引起的一种急性接触性传染病和人兽共患病,也是一自然疫源性疾病。
病死率高居各传染病之首,几乎达100%。
临诊特征为怕光、怕声、恐水、感觉过敏、神经兴奋和意识障碍,继之局部或全身麻痹而死。
全世界每年有数以百计的人死于狂犬病,因此狂犬病对动物安全和人的身心健康构成了极大威胁。
狂犬病在世界范围内广泛存在,当今世界的167个国家和地区中有87个存有狂犬病,其中绝大多数病例(98%以上)与犬有关。
根据世界卫生组织(WHO1998)的报告,以亚洲发病数最高(占50.99%),其次为非洲和美洲(各为35.2%),欧洲为1.9%,而大洋洲无狂犬病。
从感染人群数与动物的关系可以看出,以家养动物对人的影响最大(其中犬和猫占96.25%),而野生动物占3.75%,其中犬是最主要的传染源(占87.8%),对人类威胁最大。
亚洲、非洲等大多数国家的狂犬病流行病学模式为犬狂犬病,仅欧洲发达国家和美国、加拿大等以野生动物狂犬病为主要流行病学模式。
美国疾病控制中心于2000年通报了49个州的7369个病例,全部为动物,没有人感染死亡的病例,比1999年上升了4.27%。
其中野生动物占了93%比例,浣熊占37.7%,臭鼬占30.1%,蝙蝠16.8%,狐狸6.1%;其他类(包括啮齿类和家畜)占了7%比例,比1999年下降了15.3%,主要品种为狗、猫、羊、牛、马和猪。
由于美国从上世纪40年代开始实施了狂犬病控制和免疫计划,已根除了狂犬病的源头 犬狂犬病,人畜狂犬病疫苗和免疫球蛋白的发展,使美国的畜间狂犬病得到了较好控制,人间狂犬病发病率也从每年100例以上降至1~2例。
为了更好地控制狂犬病的发生和流行,必须加强诊断学的研究和发展。
由于狂犬病的特征特点,要求实验室方法必须标准化、快速、敏感、特异、经济和可靠。
建立常规诊断检测方法,对及时处理感染者并实施必要的防治措施提供了技术依据;而阳性狂犬病病例的实验室鉴定,可帮助对目前狂犬病流行病学模式的确切描述,并指导狂犬病控制计划的正确实施。
对感染动物的诊断,直接荧光抗体试验(DFA)是最常用的方法,样品为可疑动物的大脑组织,但仅用于尸检;对感染病人的诊断,尸检也可采用DFA法,生前诊断则有多种方法,仅用一种方法是不够的,样品可采取唾液、血清、脊髓液和颈背毛囊的皮肤活组织。
唾液可进行病毒分离或RT-PCR,血清、脊髓液可用于检测狂犬病相应抗体,皮肤活组织样品用于检查毛囊底部的皮肤神经中的病毒抗原。
目前标准方法是DFA,本试验已被评估及实施了40多年,被认为是所有检测方法中最快速可靠的常规技术,美国所有的狂犬病检测实验室均采用本方法用于可疑动物的尸检。
其它涉及诊断、检测和研究的方法包括电镜观察、组织学检查、免疫组化、RT-P CR和细胞培养分离病毒等,可用于研究病毒结构、组织病理学、分子类型和毒力等。
1 狂犬病病毒抗原的检测方法1.1 直接荧光抗体试验(DFA):是被WHO和O IE同时推荐的诊断方法,是一种检测感染动物组织中狂犬病固定株和野毒株的诊断试验。
此方法快速可靠,同经典动物接种试验高度相关。
本试验原理为以异硫氰酸荧光素(F IT C)标记的抗狂犬病毒免疫球蛋白同待检组织中的狂犬病病毒抗原进行反应后,F IT C作为荧光染料,在一定波长的紫外线激发下,可释放出可见的黄绿色荧光,从而检出抗原存在部位的特异性抗原-抗体复合物。
检验时可直接取新鲜患病动物的海马角、小脑或延髓制成涂片,以高质量的冷丙酮固定,用特异的结合物染色后镜检。
对于新鲜病料,本试验可在4小时内得出可靠结果,准确率达95%~99%。
本试验也能用于检测细胞培养物或被接种的小鼠脑组织中的狂犬病抗原。
甘油保存的样品经冲洗后可用于DF A试验,而福尔马林固定的样品只有经酶处理后才能进行。
1.2 快速狂犬病酶联免疫诊断方法(RR EI D):WHO也推荐法国Pasteur研究所研制的RREID试剂为标准诊断试剂,用于检测脑样品中狂犬病核蛋白。
将样品在缓冲液中粗略绞碎或是组织培养液,离心后收集上清,加入至抗体包被的微孔板内孵育,随后结合的抗原用过氧化物酶标记的抗核蛋白IgG鉴别,再加入底物行酶显色反应,最后用4N硫酸终止后测定OD492nm值,结果的判定可分为定性和定量二种。
本方法可用于可疑动物脑悬液的检测,不能用于福尔马林固定的样品,因为固定的抗原不溶,无法与免疫吸附物结合。
1.3 组织病理学检测:是在现代诊断方法建立以前的通用检测方法。
当感染动物的大脑组织经染色(如苏木精染色、姬姆萨和伊红染色)后,有经验的显微专家可发现脑炎的证据,但本试验并不认为是诊断狂犬病的特异方法,灵敏度也不高,特别是当样品出现自体分解的情况下,即使是新鲜样品也会有40%的假阴性结果。
狂犬病脑炎在大脑组织和脑脊膜的组织病理学变化,包括单核细胞浸润、血管周淋巴细胞或多型核白细胞成套,淋巴细胞聚集,内基小体的形成,由神经胶质细胞组成的巴贝斯结节的形成等,而其中内基小体(N eg ri)的检出最为重要。
内基小体呈圆形或椭圆形,存在于感染动物的神经细胞的胞浆内,大小为0.25~0.27 m,内基小体最常发现于海马角的锥状细胞和小脑的浦肯野氏细胞中,也发现于不同神经节和髓质细胞及唾液腺、舌、和其它器官的神经元。
可用姬姆萨等染色法区分内基小体,内基小体呈品红色,内有小的深蓝或淡紫色嗜碱颗粒。
在人工感染的病例中,有的脑组织含有内基小体,有的则没有。
临床病例的组织学检查中,发现50%样品含有内基小体,所以检测内基小体的存在仅作为狂犬病的辅助诊断方法。
1.4 免疫组化(IHC)试验:本试验是检测福尔马林固定的组织样品中抗原的敏感特异方法,借助于酶标记技术的放大性和专一性,其敏感性优于组织学染色法。
另外,单克隆抗体可用作检测和鉴定狂犬病病毒的变异株。
(下转左页第34页中)35!上海畜牧兽医通讯∀ 2004年第4期洗手,经消毒池消毒才可通过参观走廊,且不准进入猪舍内部。
要进行定期消毒,消毒的目的是消灭环境中可能存在的病原微生物,以切断传播途径,阻止疫病发生和蔓延。
最短必须间隔3天,进行全面彻底地消毒。
平时结合饲养管理应进行随时预防消毒,搞好环境卫生,注意通风,避免高温、高湿及有害气体的危害,及时消除使猪体抵抗力下降的各种因素。
为了防疫灭病工作,必须采取#防预结合,以防为主∃的方针,和其它规模化猪场一样,一定要实施科学的免疫程序,最大限度地降低猪的发病率。
4 猪舍的环境控制根据猪的生物学特点,采取工程技术措施,为猪创造良好的生存环境是近交系猪群饲养管理的重要标志和手段。
4.1 温度:为猪创造适宜的环境,以克服自然因素的不良影响,最重要的是防寒与降暑。
在现代化管理的猪舍内可采用空调使舍温达到猪最适宜的生存温度,一般在15~20%之间波动,可根据猪的反应情况具体调节,产仔栏温度要适当高点,因仔猪怕寒。
4.2 湿度:高湿和低湿对猪的健康和生产力都有不良影响,多以相对湿度来衡量空气潮湿的程度。
适宜的范围是65%~75%,可通过现代化的干燥、湿润设备来保持。
4.3 光照:光照是猪舍小气候的重要因素之一,对猪的健康有很大的影响。
可分为自然采光和人工光照两种,在现代化的猪舍,有大面积的可采光的玻璃,必要时也可辅以人工光照。
4.4 通风换气:通风换气可缓和高温对猪的不良影响,在封闭式饲养的近交系猪舍,通风换气可排除舍内污浊的空气。
猪舍的通风分为自然通风和机械通风,自然通风是利用自然界的风力及温差形成的风压和热压使空气自然流动进行舍内外空气交换。
在现代化饲养的近交系猪舍内,靠自然通风不能完全满足猪的卫生和饲养要求,此时要用机械通风方式,根据猪舍内的具体情况和条件如产生的CO2总量、水汽或过多的热量计算通风量,然后按通风量和通风方向选择风机,确定安装台数。
5 完善科学管理体系要有责任心强、业务熟练的专业技术人员和管理人员。
饲养员或实验员一上班,首先应检查水、电、换气、空调等设施的运转情况,登记好温度、湿度,然后观察猪情、饮水、饲料情况,猪的健康情况(特别注意粪便是否正常),还有产仔、哺乳仔猪情况,如有异常,应迅速处理,并报告技术员。
管理人员更要认真细致,从近交的第一世代开始,必须做好详细的配种记录、产仔记录和系谱。
要定期称重,量体高、体尺等各项指标。
保证每头猪的遗传背景清楚,只有这样才能确保严格的近交。
6 展望近交系猪的育成非常不容易,常常凝结着几代科学家、专家、教授、技术员和工人等的汗水,而近交系猪因具有基因纯合度高、遗传背景清楚、与人体在多方面相似等优点而成为异种器官移植研究领域中不可代替的实验模型,甚至可能是异种器官移植中组织和器官的最可靠提供者,所以近交系猪群的饲养管理显得尤为重要,一定要用现代化的管理体系来使它更趋向程序化,使它为人类造福。
参考文献&1∋张仲葛,黄惟一,罗明等.中国实用养猪学&M∋.郑州:河南科学技术出版社&2∋刘震乙,盛志廉,吴显华等.家畜育种学&M∋.北京:中国农业出版社&3∋张忠诚,梁冠生,杨利国等.家畜繁殖学&M∋.北京:中国农业出版社&4∋Leland H.Hartw ell,Leroy Hood,M ichael L.Goldberg et al.Geneti cs from genes to Genomes&M∋(影印版).北京:科学出版社&5∋刘荣宗,康孟松.近交实验动物遗传质量监测之遗传标记类型的探讨&J∋.1995,17(增刊):60~62&6∋霍金龙,张娟,罗古月等.近交系实验动物在生物医学等领域中的研究和应用&J∋.动物科学与动物医学,2003,20(12):59~61&7∋霍金龙,罗古月,张娟等.新型实验动物 近交系猪的应用前景&J∋.中国牧业通讯,2004,(4):68~70(上接右页第35页下)1.5 动物接种试验:取患病动物的大脑皮层、海马角、小脑和延髓等脑组织研磨后,用含抗生素的等渗培养液(如Hanks 液)制成20%(W/V)匀浆,离心取上清,接种于3~4周龄的无特定病原(SPF)小鼠脑内,接种量为0.03ml/只,小鼠至少观察28天,第5天开始出现麻痹或其它神经紊乱症状而死亡时,可确诊为狂犬病,最好用DAF试验加以确认。
1.6 其它方法:仅含少量狂犬病病毒的样品很难用常规检测方法进行确认,因此可将病毒在细胞培养物上复制,增加病毒浓度。
鼠神经细胞瘤细胞系(M NA)和乳仓鼠肾细胞(BHK)可提供病毒的体外复制,以适当的培养基在CO2环境下培养,48小时后用DFA试验检测狂犬病病毒核衣壳抗原的存在。