Flow + + + Relatively easy
Imaging + + +
More difficult
Multiple parameter analysis (>5) Simultaneous analysis of multiple parameters
Analysis of properties of a single parameter Costly technique
Single Stain Controls - which reagents?
Caveats for substituting reagents:
– Controls should be as bright as possible
• As bright or brighter than the experimental stains
• spillover varies from reagent to reagent
补偿
• 荧光色谱发出的荧光通常有一个很大的波普范围
（ ≥100nm ） • 每个检测器能够检测到一种以上的荧光色谱 (spillover or bleed over) • 需要通过补偿来使得一个检测器只检测一种荧光
Differences/Similarities between Flow and Imaging Property
Population analysis/Statistics Single cell details/architecture Live cell sorting (analysis??) Analysis in native microenvironment Analysis of cellular functions (e.g. Ca++ influx) Need to use a substrate for cell “support”
流式细胞术 Flow Cytometry，FCM
FCM
• Flow ~ cells in motion
• Cyto ~ cell
• Metry ~ measure
• Measuring properties of cells while in a fluid stream • FACS - Fluorescence Activated Cell Sorting? FACS is a trademark of Becton Dickinson Immunocytometry Systems (BDIS). All FACS instruments are BDIS systems, but not all cytometers are FACS.
– GFP, CFSE, and FITC are NOT the same fluorochrome
• even though they are all green!
– With tandem dyes (Cy5PE/Cy7PE etc.) it is necessary to use the exact same reagent
样本单细胞悬液的制备
新鲜实体组织样本的制备
酶消化法
机械法（剪碎法、网搓法、研磨法 化学处理法（胰酶+0.2%EDTA） 组织活检、内窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备 石蜡包埋组织样本的制备 300目）
外周血单个核细胞样本的制备
骨髓细胞单细胞悬液的制备 培养细胞的单细胞悬液的制备 脱落细胞样品单细胞悬液的制备
+/+ +
+/+ +
Archiving of permanent records
+
+/-
Electronics
Laser
Voltage
Low signal height High signal height
Time
Laser
Voltage
Time
Voltage
Laser
h
Time
Count
Intensity
C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备： （1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。 （2）用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存 ，至少固定18小时（过夜）。 （3）调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细 胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。
刺激方法
小鼠IL-2 小鼠IL-4 方法1 方法2
小鼠IL-5
小鼠IL-6 小鼠IFN-γ 小鼠TNF-α
方法2
方法3 方法1or 方法4 方法1
方法1: 细胞在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时 方法2: CD4＋T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠 的CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2和IL-4的培养基培养两天；然后在含有 重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA(5 ng/ml)、 Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。 方法3: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时 方法4: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时
FCS和SSC
• FSC（大小）和SSC（内部结构）, 用这二者 能区分出一群细胞中的不同细胞群。
粒细胞 淋巴细胞
SSC
单核细胞 红细胞、碎片 和死细胞
FSC
画门（Gating）
Whole blood light scatter
流式细胞术的应用
• 细胞群比例及表型测定(CD4+/CD8+ T cells) • 细胞因子（激活的细胞因子、CBA）
• 细胞增殖（CFSE、Brdu）
• 细胞凋亡(PI、Annexin V、TUNEL)
• 细胞周期（PI、DAPI）
• 细胞吞噬杀伤能力（CFSE、CMFDA） • 信号通路 • 其他（ROS、Ca2+）
FCM 数据分析
• 通过流式细胞仪获得实验结果（FACS检测获 得 .fcs文件） • 用专业流式分析软件进行操作（Free or Commercial ） • 分析方法取决于你的实验数据和实验者的实验 方法 • 任何操作都是将你所获得的数值转化成你所关 注的样品信息。
常见流式图类型（2D）
3D
抗体标记方法
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。 (2) 用1ml含5% 血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离 心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗 体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上（4℃）放置30min,
离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
(3) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
B. 未标记抗体间接免疫荧光标记法：
（1）收集1×106个细胞，用冷的PBS 2ml 洗涤细胞一次，800rpm离心 5min。 （2）加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min，用 2ml冷的PBS 重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。 （3）加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40min后， 800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。 （4）加入0.5ml 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。 （5）流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
所需试剂
• 荧光标记的细胞因子抗体：FITC、PE和APC标记的细 胞因子抗体（BD、eBioscience、Biolegend、R&d） • 溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素溶解红细胞
• 激活剂
• 阻断剂（BFA） • 不含谷氨酰胺的RPMI-1640 • 固定透膜剂 • 其它试剂：无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛 的PBS，4℃储存。
（4）PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升。
胞内细胞因子检测
• 目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、 原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting
dilution analysis，LDA）和单细胞PCR。
• 原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA 表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信 号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且 人肉眼识别能力有很大的局限性。 • ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以 进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术
激活剂
• Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)
• Ionomycin
• Staphylococcal enterotoxin B(SEB) • CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀 释的血液细胞 • CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应， 浓度一般为10ug/ml
对照
• 空白对照 - 设定PMT电压 ，检测自发荧光, 有时作为阴性对照 • 补偿对照（单标） -纠正光谱外溢 • FMO(Fluorescence minus one,荧光减一) 对照 - 圈定阳性群 • 生物学对照 -实验对照 (untreated vs treated) - 同种型(for non-specific binding)