5 ＤＮＡ和蛋白质技术
5.1 ＤＮＡ的粗提取与鉴定
1.提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
DNA的粗提取就是利用DNA与RNA、蛋
白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其
他成分。
2.DNA粗提取的原理：1）DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的
NaCl溶液中的溶解度不同。
所以一般选用2mol/L的NaCl溶液充分溶解DNA,使杂质沉淀，再缓慢注入蒸馏水使NaCl溶液浓度接近0.14mol/L，使DNA析出。
2）DNA 不溶于酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。
所以可用体积分数为95%,预冷的酒精溶液来提纯DNA。
3.提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。
1）酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。
2）温度值为60～80℃时，会使蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。
3）植物细胞提取DNA时，常用洗涤剂瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
4.在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，可以检测DNA的存在。
5.选用DNA含量相对高的生物组织提取DNA，成功的可能性更大。
哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和细胞器，不适宜用来提取DNA，但适宜用来提取血红蛋白。
6.实验设计过程：1）实验材料的选取：本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。
一是因为其DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。
2）破碎细胞，获取含DNA的滤液：往鸡血细胞中加一定量的蒸馏水，同时用玻棒搅拌，使细胞吸水胀破释放DNA，过滤取DNA滤液。
3）去除滤液中的杂质：往DNA滤液中加入2mol/L的NaCl溶液，过滤除去不溶的杂质。
再加蒸馏水调节NaCl溶液浓度接近0.14mol/L，析出DNA，过滤去除溶液中的杂质。
4）DNA的提纯：将析出的DNA用2mol/L的NaCl溶液溶解过滤取滤液，加入与滤液体积相等的、预冷的体积分数为95%的酒精溶液，静置2-3分钟，析出白色丝状物即为粗提取的DNA。
5）DNA的鉴定：白色丝状物溶于5mL2mol/L的NaCl溶液，加入4mL二苯胺，沸水浴5分钟后观察到DNA溶液呈蓝色。
7.注意事项：在鸡血中要加入柠檬酸钠防止凝固；玻璃容器会吸附DNA，所以提
取过程使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；加入酒精和用玻棒搅拌时，动作要轻缓（细胞破裂快速搅拌），沿同一方向搅拌，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
二苯胺试剂要现用现配等。
5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段
1. PCR又叫多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩张DNA片段的技术，其复制过程与细胞内DNA的复制类似。
需要：1）解旋酶（打开DNA双链）；2）DNA母链（提供DNA复制的模板）；3）四种脱氧核苷酸（合成子链的原料）；4）DNA聚合酶（催化合成DNA子链）5）引物（使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸）。
2.为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基（-OH）末端称为3，端，而磷酸基团的末端称为5，端。
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3，端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。
当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3，端开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的5，端向3，端延伸。
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3.PCR利用了DNA
使用的PCR
PCR
反应需要在一定的
DNA
DNA
复制在体
外反复进行。
4.PCR一般要经历30
温度上升到
DNA解聚为单链。
复性指当温度下降到
DNA结合。
延伸指当温度上升到
A、T、C、G）在DNA
聚合酶的作用下，根据碱
基互补配对原则合成新的DNA链。
5PCR
酶吸
6.DNA在
可以利用这一特点进行
的测定。
5.3 血红蛋白的提取和分离
1.负责血液中
2.溶解度、
吸附性质和对
3.
法。
内部有许多贯穿的通道，
当相对分子质量
质因此得以分离。
4.
20mmol/L
PH为
7.0）。
5.许多重要的生物大分子，
如
在一定的PH下，
在电场的作用下，
电泳利用了
待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同使带电分
6.
样品的处理及粗分离包括：1
2
3
4）透析：把血红蛋白装入透析袋，置于20mmol/L磷酸缓冲液（PH为7.0
）中，除
7.用缓冲液平衡好的凝胶装填色谱柱时，
降低分离
8.血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯
度鉴定。
首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，
再经过透析去除分子量较小的杂质，
然后通过凝
即样品的纯化；
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