其次为生物基质中待测药物稳定性的验证 ——室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环
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•第四章 分析方法的建立与验证 •第三节 分析方法的验证与要求
验证的效能指标与基本要求
1．特异性——避免干扰 2．标准曲线与线性范围——覆盖所有浓度范围 3．准确度——与实际状况相符 4．精密度——结果可重现 5．定量限——达到峰浓度的1/10～1/20 6．稳定性——确保所有样品准确测定 7．提取回收率——确保准确度
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•第四章 分析方法的建立与验证 •第一节 分析方法的设计依据
二、分析测定的目的与要求
体内药物分析的目的——影响分析方法的应用
药代动力学——研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 ——血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物
要求 ——同时测定原形药物和代谢产物 检测 ——宽线性范围(Cmax～Cmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属
——需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品 的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验
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2. 空白生物基质试验
•第四章 分析方法的建立与验证 •第二节 分析方法的建立步骤
空白生物基质 (blank biological matrix) ——如空白血浆 ——照 “1. 空白溶剂试验” 项下方法操作
分析方法的建立和验证过程——是不可截然划分的 ——为便于讨论而分别叙述
分析方法的建立步骤 ➢ 第一步：检测条件的筛选 ➢ 第二步：分离条件的筛选
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(一)检测条件的筛选
•第四章 分析方法的建立与验证 •第二节 分析方法的建立步骤
标准物质 —— 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定
以血浆或血清为分析样品 采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC检测
用RIA分析 ——样品的预处理方法可较为粗放 ——经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定
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四、实验室条件
•第四章 分析方法的建立与验证 •第一节 分析方法的设计依据
在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑 到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪 器装备，合理选择可行的分析方法。
生物样品中的药物浓度——决定分析方法的首要因素 生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少
——难以通过增加取样量提高方法灵敏度 ——通过选择适当的分析方法适应样品分析需求 体内药物分析中常用分析方法——特点见表4-1
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二、分析方法的建立
•第四章 分析方法的建立与验证 •第二节 分析方法的建立步骤
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•第四章 分析方法的建立与验证 •第三节 分析方法的验证与要求
一、方法特异性(专属性或选择性)
方法的特异性(specificity)
——又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用
——系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力
专属性——表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的
结构已知的特定活性代谢物的测定
——必要时通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性
对于结构未知的代谢产物的测定
——可采用LC-LC-NMR进行结构的初步推测后，考察其干扰情况
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3. 伍用药物的干扰
•第四章 分析方法的建立与验证 •第三节 分析方法的验证与要求
—— 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度
HPLC —— 调整检测器(类型、条件)
色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)
流动相(组分及其配比)及其流速
柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等
—— 使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)
良好的色谱参数(n、R、T)
适当的保留时间(tR)
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•第四章 分析方法的建立与验证 •第一节 分析方法的设计依据
一、待测药物的理化性质及体内存在状况
准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物 ——预处理——待测物从结合物或缀合物中释
放 选择样品预处理方法——首先应考虑
——待测药物的理化性质 ——药物在生物体内的存在状况 ——药物在生物体内的生物转化(代谢)途径
确证——内源性物质对分析方法有无干扰
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2. 代谢产物的干扰
•第四章 分析方法的建立与验证 •第三节 分析方法的验证与要求
比较——模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号
与代谢产物(在实际样品中 tR 随时间延长而增加)的 R 如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 〔或改变色谱条件(色谱柱)再比较〕 确证——其它代谢产物对分析方法有无干扰
实际生物样品——确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试 考察目标 ——代谢产物对药物、内标物质的干扰情况
——进一步验证方法的可行性
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•第四章 分析方法的建立与验证
第三节 分析方法 验证的内容与要求
用于实际生物样品分析之前
——验证 (validation) 分析方法的可行性与可靠性
选择性——系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区
分(分离)的能力
特异性——函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性
考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：
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1. 内源性物质的干扰
•第四章 分析方法的建立与验证 •第三节 分析方法的验证与要求
比较——待测药物或其活性代谢产物检测信号 对照品（或标准品） 空白生物基质 模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品） ——如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致 及与内源性物质色谱峰的 R
TDM 时 ——还要考虑患者可能同时服用药物(通常为数有限)的干扰
比较——待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号 ——如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致
➢ 分析方法建立之前
查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程，使所 拟定的分析方法
——避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定
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二、分析方法的建立
•第四章 分析方法的建立与验证 •第二节 分析方法的建立步骤
➢ 初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作——选择最佳分析条件 同时验证分析方法的可行性——确认是否适用于实际生物样品
考察目标 ——方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度 药物的萃取回收率等各项技术指标 ——同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的
其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性
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色谱分析法
•第四章 分析方法的建立与验证 •第二节 分析方法的建立步骤
——进一步考察待测药物(或内标物)与内源性物质(或其它药物)的 分离情况
考察目标 ——生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性） ——在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗
”（信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号
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3. 模拟生物样品试验
•第四章 分析方法的建立与验证 •第二节 分析方法的建立步骤
模拟生物样品(质量控制,QC样品)——空白生物基质中加入待测药物 ——照 “1. 空白溶剂试验” 项下方法操作
中毒患者的临床抢救 药物浓度极高
方法——不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度 ——大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA
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•第四章 分析方法的建立与验证 •第一节 分析方法的设计依据
三、生物样品的类型与预处理方法
生物样品的类型与预处理方法——决定分析方法的应用
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1．空白溶剂试验
•第四章 分析方法的建立与验证 •第二节 分析方法的建立步骤
待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液） ——采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等） ——测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高）
考察目标 ——方法的特异性 ——空白值应尽可能小，并能有效校正
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(二)分离条件的筛选
•第四章 分析方法的建立与验证 •第二节 分析方法的建立步骤
在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢 产物对分离与检测的干扰，步骤如下：
1．空白溶剂试验 ——溶剂(方法特异性) 2．空白生物基质试验 —— endogenous compounds(方法特异性) 3．模拟生物样品试验 —— 方法效能指标 4．实际生物样品测试 —— 代谢产物(方法特异性)
体内药物分析方法的建 立与验证
2020年5月26日星期二
本章内容提要
•第四章 分析方法的建立与验 证
分析方法的设计依据 分析方法建立的一般步骤 分析方法验证的内容与要求 体内药物分析应用示例
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•第四章 分析方法的建立与验证
第一节 分析方法的设计依据
建立分析检测方法的主要依据 ➢ 待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况 ➢ 分析测定的目的与要求 ➢ 生物样品的类型与预处理方法 ➢ 实验室条件
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•第四章 分析方法的建立与验证 •第一节 分析方法的设计依据
(二)待测药物的体内存在状态
与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低 ——分离萃取方法 蛋白结合较强——不宜直接采用溶剂萃取