3’ nnnnnnnC 连接
Gnnnnnnn 5’
• 2、用于去除一段序列
• 1、通过酶切的方法 • 酶的选择： • 1、选择黏性末端的酶 • 2、选择配合较好的酶 • 3、避免平末端酶 • 4、避免同尾酶 • 如 bamh1 GGATCC和 bgl2 AGATCT
• 2、PCR获得 • 一、引物设计 • 一般在扩增引物的5’端增加酶切位点，并且
加保护碱基。 •如
• 3、基因合成 • 在合成基因的同时，应将用于克隆的酶切
其他克隆技巧
1、同尾酶 因同尾酶如 bamh1 GGATCC和 bgl2 AGATCT。 具有相同的黏性末端，所以这两种酶是可以 连接在一起的 用途，当目的DNA上有酶切位点限制时可以 选用同尾酶替换。
目的基因上有bamh1，可用bgl2来代替。
• 2、补平 • 1、用于去酶切位点 • SAC1酶切位点
位点一起合成。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• 克隆载体： • 一、通过酶切获得的载体 • 二、PMD18-T • 三、topo载体
• 一、通过酶切获得的载体 • 1、有合适酶切位点的载体，如：
• 2、无合适酶切位点的载体 • 这里可以用两中方法来做 • 1、通过突变PCR方法 增加酶切位点 • 2、将整个载体PCR下来，然后在引物两端
普通连接
目的：分离一个已知DNA序列，并以活体内
方式获得许多复制品的过程。这一复制过程 经常被用于增加并获取DNA片段中的基因， 但也可用来增加某些任意的DNA序列，如启 动子、非编码序列或是随机的DNA片断。
方法
• 一、目的DNA的获得 • 1、通过酶切的方法 • 2、PCR获得 • 3、基因合成
• 二、PMD18-T • 本载体1 μl（50 ng） • 进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA 的摩
尔数比一般为1：2～10
• Solution I=pMD18-T Vector+insert
• 三、topo载体 pEASY - Blunt Cloning Vector (10 ng/μl) 1、最佳插入片段DNA量：载体与片段摩尔比=1：7 2、最佳反应体系3-5 μl ，体积不足时可以补充无菌水
5’ nnnnnnnGAGCTCnnnnnnn 3’
3’ nnnnnnnCTCGAGnnnnnnn 5’ 酶切后
5’ nnnnnnnGAGCT 3’
Cnnnnnnn 3’
3’ nnnnnnnC
5’ 3’ TCGAGnnnnnnn 5’
Pfx 具有 3’5’外切酶活性，补平后
5’ nnnnnnnG
Cnnnnnnn 3’
增加两个酶切位点。
• 如：
二、PMD18-T
用于PCR 产物的3’ 末端添加一个“A”，如TAQ酶
三、topo载体
用于平端克隆，如PFX KOD 直接PCR
操作
一、酶切载体 1、酶切 目的DNA及载体酶切，操作见： SOP酶切（用于鉴定&回收）
注：1、载体酶切要完全 2、胶回收后要电泳标定浓度