Single gene shuffling library of point mutants
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Family gene shuffling library of chimeras
Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis
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2008年诺贝尔化学奖介绍
评论
生物学有些现象只能在打碎细胞以后才能做，所以实际 上是从“死物”上来推测生物的情况。而下村修、钱永健 和马丁· 沙尔菲发明的用荧光分子标记其他分子的方法，使 科学家们能在活细胞、活生物上直接观察一些生物现象。 所以，可以说是把一些“死物学”变成了真正的“生物学 （北大饶毅）
• 难点
• 突变库容量大，一般达到106，工作量巨大
• 关键
• 高通量筛选：通量大，效率高
• 方法
平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表 面展示法
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8.3 突变基因的筛选
• （一）定向选择环境条件的设立 • 例：为提高酶的热稳定性，可以在较高的温 度下培养重组细胞，并在每一次“突变－筛 选”的循环中逐步提高培养温度
Generating chimeras with crossovers of large blocks of sequences
Contents of chapter 8
8.1进化的应用308.2 突变基因的构建8酶的定向进化
酶定向进化的概念： 模拟自然进化（随机突变和自然选择） 的过程，在体外进行酶基因的人工随机突 变，并在人工控制条件的特殊环境下进行 定向选择，得到具有优良催化特性的酶的 突变体。所得到的酶称为进化酶。
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酶的定向进化
• 主要过程： 1、随机• 基因重组（of chapter 8
8.1进化的应用
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8.3 突变基因的筛选
• 目标
• 根据定向进化要求，形虫体内植入 绿色荧光蛋白质
绿荧光水母—通过体内绿色 荧光蛋白发光
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绿色荧光蛋白的应用
分子标记：GFP标记的微管结构
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3、噬菌体表面展示法
利用丝状噬菌体的外 膜结构蛋白与某些 特定的外源蛋白或 多肽分子形成稳定 的复合物，使外源 蛋白或多肽富集在 噬菌体表面的一种 分子展示技术
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基因家族重排技术（1998,Crameri）
• 单一酶分子基因：进化过程中集中有利突变 速度较慢
• 基因家族：由于基因之间存在显著差异，所 得突变库体现了基因多样性和增加了有利突 变的概率 • 由于定向进化的高效性，被认为是DNA改组 的发展方向
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单基因重排Vs基因家族重排技术
.. . . . .... .
利用自身荧光激发特性
生成产物本身是具有荧光激发特性的物质
利用荧光报告基因 辣根过氧化合物酶和单加氧酶的融合基因： 原理：萘→萘酚→醌类化合物（能激发荧光） 绿色荧光蛋白基因：获2008年诺贝尔化学奖
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2008年诺贝尔化学奖介绍
获奖
2008年度诺贝尔化学奖授予日本科学家下村修、美国科 学家马丁· 沙尔菲，以及美国华裔科学家钱永健。他们三人 因为在绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）研究和应用方面做出的突 出贡献将各分得2008年度1／3的诺贝尔化学奖奖金。
定向选择： • 先把随机突变获得的突变基因做成基因文 库，再从中筛选出有用的突变基后筛选出完整的进粒、噬菌体载体、黏粒质 粒、噬菌体质粒）
蛋白质与酶工程
Chapter 8 Enzymatic Directed Evolution
第八章 酶的定向进化
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酶工程：酶（酶制剂）的生产、改性和
应用的技术过程。
生产
• 微生物发酵产酶 (Chap. 2) • 动植物细胞培养产 酶(Chap. 3) • 酶的提取与分离纯 化(Chap. 4)
改性
4、酵母表面展示法
• 通过锚定在酵母细胞表面的特点蛋白质与 某些外源蛋白质或多肽形成稳定的化合物， 使外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的 一种分子展示技术。 • 凝集素
Contents of chapter 8
8.1进化的应用
• 酶分子修饰 (Chap. 5) • 酶/细胞/原生质体 固定化 (Chap. 6) • 酶非水相催化 (Chap. 7) • 酶定向进化 (Chap. 8)
应用
• 酶反应器 (Chap. 9) • 酶的应用 (Chap. 10)
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物种的自然进化
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定向进化（directed evolution）
3、突变基因的筛选（获得正突变）
Contents of chapter 8
8.1进化的应用
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8.1 酶基因的随机突变
随机突变的技术 • 无性突变技术：

易错PCR (error-prone PCR)
• 有性突变技术：
• 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ • 提高Mg2+浓度
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1、易错PCR
• 优点：操作简便，随机突变的定向进化
• 难点：要控制好突变率
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1、易错PCR
连续易错PCR： 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一 次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。


DNA 改组 (DNA shuffling)
交错延伸PCR 随机引物体外重组 基因家族重排
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PCR
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1、易错PCR
• Taq酶不具有3’5’ 方向的 外切酶活性，有一定的错配 几率（5×10-5） • 易错PCR：提高PCR过程 的错配几率
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1、易错PCR
方法：
• 改变4种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降 至5％-10％），同时加入dITP来代替被减少的 dNTP；
• 极端环境：高盐、低温、高浓毒物质
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1、平板筛选方法
（2）依据颜色变化筛选
反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚
脂肪酶筛选
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1、平板筛选方法 （3）依据透明圈大小筛选
淀粉酶的进化：淀粉平板培养基
豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基
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2、荧光筛选法

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2、荧光筛选法
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酶的定向进化
• 基于序列的理性设计：分子修饰
利用已知酶分子的空间结构、结构和功能之间关系， 以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行改造； • 利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：定向进化 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基 因重组等方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因， 并定向筛选出所需突变酶；
（1994，Stemmer)
1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
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DNA shuffling
How DNA shuffling is done in the tube
Random fragmentation of a pool of related genes; Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers);
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8.3 突变基因的筛选
• （二）高通量筛选：通量大、效率高，可迅 速判断哪些是正突变 平板筛选法 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 酵母细胞表面展示法
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8.3 突变基因的筛选
1、 平板筛选
（1）依据细胞生长情况筛选
• 热稳定性：温度梯度和高温环境
• 抗生素耐受性：抗生素浓度梯度
• pH稳定性： pH梯度
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2、DNA改组 (DNA shuffling)
• DNA割成随机片段，经过不加引物 的多次PCR循环，获得重新排列的突变 DNA的过程。
有性进化：DNA改组方法（1994，Stemmer)
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正突变
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DNA重排原理图
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交 错 延 伸 突 变 法 PCR
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随机引物体外重组(1998, Arnold)
• RPR (Random-priming in vitro recombinatoion)
• 在以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物， 先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段。 • 去除模板后，在随后的PCR反应中，它们互为 引物和模板进行合成，伴随组合，再组装成完 整的基因长度。
PCR amplification with primers of reassembled products
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DNA shuffling
方法：从正突变基因库中分离得到的DNA序列用酶随 机切割，得到的随机片断经不加引物的多次PCR循环， 获得全长基因，实现优势突变的组合； 特点：遗传变化仅发生在来自不同基因片断之间的 重组，所以称为有性进化； 优点：将已有的正突变基因结合，正突变效率高； 缺点：无引物PCR之前必须把DNase I去除干净，以 防突变基因的被切割；
• 自然进化
随机突变 自然选择 Vs.
• 定向进化
人工随机突变 人工定向选择
基因的定向进化 蛋白的定向进化 酶的定向进化 细胞的定向进化 。。。
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酶的定向进化
Vs. • 理性设计 rational design 找出酶的关键 结构，有目的 地改造
• 定向进化
不需要事先知道 酶的空间结构、 活性位点等

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不需加DNAI的DNA重排技术
• 交错延伸PCR • 随机引物体外重组技术
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交错延伸PCR(1997, Arnold)