实验设计
——肉毒杆菌毒素对神经-肌
肉接头的影响
肉毒杆菌毒素对神经—肌肉接头处兴奋传递的影响
————实验设计
实验原理：
神经-肌肉接头是由接头前膜、接头后膜和接头间隙三部分组成。

运动神经纤维到达骨骼肌细胞时，其末梢失去髓鞘，嵌入肌细胞膜。

当动作电位到达神经末梢时，接头前膜的电压门控Ca2+通道打开，可引起大量Ca2+由细胞外进入接头前膜，使接头前膜将ACh释放到接头间隙。

ACh通过接头间隙到达接头后膜（终板膜）是，立即与终板膜上ACh受体（氮气受体）结合，使通道开放，允许Na+和K+等通过（以Na+为主），因而引起终板膜静息电位减小，使终板膜去极化。

一次终板电位一般都比相邻肌细胞膜阈电位大3～4倍，所以很容易引起邻近肌细胞膜爆发动作电位，引起骨骼肌细胞的兴奋。

肉毒杆菌毒素通过与胆碱能神经元的突触前膜结合，再进行细胞内吞，形成一个包裹毒素分子的酸性小泡。

此酸性小泡滞留在运动神经元的突触前膜的末端。

含有神经递质ACh的突触小泡在突触前膜上锚定、融合，以及ACh向突触间隙释放均需要一组SNARE蛋白的介导。

而肉毒杆菌毒素能特异性切割SNARE蛋白，阻止转运小泡中ACh的释放，阻断神经传递，从而引起肌肉麻痹。

实验目的：
1、了解家兔的解剖结构。

2、探究肉毒杆菌毒素对神经—肌肉接头处兴奋传递的影响。

实验对象：家兔
实验仪器和试剂：
气管套管、换能器、动物人工呼吸机、生物信号采集处理系统、兔手术台;200g/L氨基甲酸乙酯溶液（取20g氨基甲酸乙酯与烧杯中溶解，转入100mL 容量瓶加蒸馏水至刻度线，倒入细口瓶待用），液体石蜡，10%肉杆菌毒素溶液（取1g肉毒杆菌毒素加入9mL水溶解，倒入细口瓶待用），生理盐水，乙酰胆碱溶液。

实验方法：
1、手术准备
(1)兔称重后，氨基甲酸乙酯
5mL/kg耳缘静脉注射麻醉。

切开气管
插入气管套管。

仰卧固定家兔，胫骨
前肌位于胫骨内侧，皮肤切口从另一
条腿膝关节向下至踝关节上（注意不
要切断皮下组织的几支血管），切断横
兔后肢外侧面解剖
韧带（在踝关节上）然后用镊子挑起
外侧最上一根肌腱，穿一线结扎，在结扎线远端的3mm处剪断肌腱，向上分离以暴漏部分胫骨前肌，立即涂以液体石蜡，加以保护。

(2)分离同侧坐骨神经（大腿凹处，股二头肌深层，分开肌肉），可见主干分成腘中神经和腓总神经，分离后在腘中神经的下方用线结扎，把电极连在腓总神经上，用液体石蜡棉球塞紧，并用止血钳夹住皮肤包紧。

另一条腿上，在股三角剪毛用手触摸股动脉，沿股动脉走向做4～5cm切口，止血钳分离皮下组织和筋膜，可见由外向内依次为股神经，股动脉和股静脉，其中动脉位于另两者之后，先小心分离神经，再分离动静脉之间的结缔组织（注意勿伤血管小分支），分离出静脉2～3cm备用，可直接用4号针头注射给药。

(3)将胫骨前肌结扎线的一端连于张力换能器钩上，连续刺激腓神经诱发胫骨前肌收缩，记录收缩曲线。

2、实验系统连接及仪器参数设置
换能器的输出端与生物信号采集处理系统的输入通道相连。

启动RM6240系统软件，进入系统软件窗口，点击“实验”菜单，选择生理科学实验菜单中的“药物对兔坐骨神经-胫骨前肌的作用”项目，系统进入信号记录状态。

仪器参数：通道模式：张力，采样频率400Hz～kHz，扫描速度1s/div,灵敏度50～100g，时间常数：直流，滤波频率100Hz。

刺激模式:单次，主周期2s，刺激波宽0.1～0.5ms可调，刺激强度1.5V。

实验步骤:
1、电刺激神经，观察记录到的张力曲线。

2、沿股静脉注射10%肉毒碱溶液(0.2ml/kg），再电刺激神经，观察张力曲线并与正常情况下的曲线对比分析。

3、在神经肌肉接头出滴加乙酰胆碱后进行电刺激，观察张力曲线的变化并分析结果。

技术路线:
预期结果:
注射肉毒碱一段时间后，观察到张力曲线同正常情况下的相比幅值减少，频率降低。

再滴乙酰胆碱后进行电刺激可观察到幅值和频率恢复大致和正常情况相同。

因此可证明肉毒碱可以影神经—肌肉接头处乙酰胆碱的释放而影响兴奋的传递。

注意事项：
1．麻醉时应先快推注射器然后慢推，以使兔子可以跟快安静下来。

2．查气管套管时应将气管内的血液清理干净，防止血液在气管中凝固堵塞气管。

3．使兔子窒息死亡。

4．分离神经和肌肉应避免血管损伤和破裂。

5．分离神经和肌肉应立即涂以液体石蜡，加以保护。

6．实验中要保持标本的湿润，以维持其兴奋性。

7．注意药物量效关系。

8．实验结束后妥善出来动物尸体。

参考文献：
《医学机能学实验教程》第二版胡还忠
《生理学》第七版
《神经肌肉接头疾病》——沈扬
《机能实验科学》——邓先科李国华
《肉毒杆菌及其毒素概述》——张建
《生理科学实验教程》——陆源夏强
《动物生理学实验教程》——金天明。