a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cdr c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因
2. 营养标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这 类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。
③ 线形DNA （ linear ，LDNA）
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一、 质粒载体
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：
SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。
OC L
SC
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一、 质粒载体
3.质粒的基本特性 质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据 在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid） (拷贝数少，为1-5个) 和松弛型复制控制的质粒（relaxed） (拷贝数多，可达10-200个拷 贝) 因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
一、 质粒载体
4.质粒的命名原则
人工组建的质粒
人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的 第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和 实验室名称，再其后为质粒的编号。如pBR322，字母p代表质 粒，BR是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表…构建的一系 质粒的编号。
两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。
具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相 同的复制子。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
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载体的要求
A、复制起点：能在受体中复制；
B、筛选标记； C、限制性内切酶切割位点； D、载体的大小：原则上要求载体越小越好； E、适当的拷贝数； F、载体的安全性：质粒不能随便转移; G、外源基因的表达：启动子。
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克隆位点
HindIII BamHI PstI
克隆位点
ScaI Amp
一、 质粒载体
i P O lacZ
β半 乳 糖 苷 酶 基 因 突 变 体
a互 补 显 色 反 应 （ 蓝 白 斑 筛 选 ）
β-半乳糖苷酶
-
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段 分解半乳糖
lacZ
分解X-gal
M15
产物呈现蓝色
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一、 质粒载体
+
-peptide
C-terminus of b-galactosiase
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一、质粒载体
大肠杆菌的质粒
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一、 质粒载体
2.质粒的空间构型 ①共价闭合环状DNA（Covalent close circular DNA， cccDNA) 呈超螺旋（SC）（super coil）
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一、 质粒载体
② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
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一、 质粒载体
质粒的可转移性
bom site Tra protein from conjugative plasmid Mob gene helper plasmid
mob mRNA Mob protein
recipient cell
ห้องสมุดไป่ตู้
即mob基因的产物可打开非接合质粒的oriT位点，借助接合质 粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这 种现象称为迁移作用(mobilization)。
X-gal
X-gal
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一、 质粒载体
互补显色反应
α互 补
(α-complementation)
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一、 质粒载体
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一、 质粒载体
常用的遗传标记基因 葡萄糖苷酸酶基因（GUS）
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。 该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因 为许多生物中没有这种基因。
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第三章 基因工程载体
第一节 克隆载体 第二节 表达载体 第三节 其它特殊用途载体
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本章重点掌握的内容
1. 掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、α互补、插入失活、人工染色体载体的概念。 2. 克隆载体DNA分子具备的条件。 3. 标记基因的分类及其作用。 4. pUC18/19质粒载体的组成、优点及质粒克隆载体用途。 5. λ-DNA载体的构建、类型及其优点。 6. 植物表达载体的组成、启动子的类型等
质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真 菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA 分子 — 眼虫、衣藻等）双链DNA 分子 （酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自 身 复制和表达。
并不是寄主生长所必需的，但可以赋 予寄主某些抵御外界环境因素不利影响 的能力（带有抗性基因等） 。
分子量在1-200kb之间 。
c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
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一、 质粒载体
常用的遗传标记基因 LacZ基因的结构与产物 P LacZα LacZβ 转录 翻译 α β
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一、 质粒载体
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
P
O
lacZ
β-半乳糖苷酶 调控蛋白P
分解半乳糖
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r
SalI
pBR322
(4.36 kb)
遗传标记基因
ori
大肠杆菌质粒载体
复制起点
pBR322结构图
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载体的分类
按功能分类
克隆载体
表达载体 整合载体 按来源分类 质粒载体
克隆一个基因或DNA片断
用于一个基因的蛋白表达 把一个基因插入到染色体组中
噬菌体载体
柯斯质粒载体 人工染色体载体
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载体的种类和特征
受体细胞 质粒* E.coli λ噬菌体 丝状噬菌体及噬菌粒 粘粒载体 E.coli E.coli E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞 动物细胞 动物细胞 和细菌 结构 环状 线状 环状 环状 环状 线性染色体 线性染色体 环状 环状 插入片断 ＜ 8kb 9 - 24kb ＜ 10 kb 35- 45kb ≈300 kb 100 - 2000 kb ＞ 1000 kb SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒 举例 pUC18/19 , T-载体等 EMBL系列， λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV Pel oBAC系列
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一、质粒载体
质粒DNA的tra基因 （指令）
E.Coli产生菌毛
宿主与受体细胞结合 （迁移） 遗传物在细胞之间转移 大肠杆菌接合（conjunction）
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一、 质粒载体
携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基
因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 物质合成 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 抗生素、细菌毒素、有机碱
质粒 pBR322 及其衍生质粒 pUC 系列质粒及其衍生质粒 pSC101 及其衍生质粒 ColE1 复制子 pMB1 突变的 pMB1 pSC101 ColE1 拷贝数 15～20 500～700 ～5 15～20
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一、质粒载体
质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)
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一、 质粒载体
质粒的可转移性
接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个 细胞（接合作用）。 甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质 粒的受体菌中。 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用。 值得注意的是，某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助 下，也能发生DNA转移，这个过程由 mob、tra 基因顺式因子bom 及其内部的转移缺口位点nic决定。
3. 生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ， GUS，CAT
4. 噬菌斑
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一、 质粒载体
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一、 质粒载体
抗 药 性 标 记 选 择 插 入 失 活 法
( )
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一、 质粒载体
常用的遗传标记基因 β-半乳糖苷酶基因（lacZα和lacZβ）
β-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋 白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β-半乳 糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为 α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编 码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZα和LacZβ） 均可作为标记基因。 β-半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性
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遗传物质 + 载体 重组的DNA分子 引入细胞或生物体内
复制与表达
稳定地遗传给下代
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基因工程流程图
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DNA：
1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区 （encoding region)和终止子（terminator)的基因，or 组成 基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的； 2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维 持。所以，通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受 体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为基因工程载体。