第一章 蛋白质的含量测定
蛋白质的含量测定
基于蛋白质的 基于蛋白质的 基于蛋白质的 元素组成特点 化学显色反应 光吸收特性
➢ 蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％ 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此 只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据 以下公式推算出蛋白质的大致含量：
100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100
➢ 蛋白质的分子量范围 15～200 KD之间
➢ 样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉 淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去
➢ 多亚基蛋白质分子量检测 ❖ SDS和巯基乙醇 ❖ 用其它方法测定分子量进行参照
➢ SDS-PAGE测定的准确性 ❖ 电荷异常或构象异常 ❖ 带有较大辅基的蛋白质 ❖ 某些结构蛋白
芳香族氨基酸的紫外吸收
优点 缺点
• 快速 • 对蛋白质无破坏性
• 不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液
• 核酸可引起强干扰作用 •芳香族氨基酸含量差异可以起误差
计算方法
• 标准曲线法
• 蛋白质浓度 (mg/ml) =1.45×A280-0.74×A260
注意事项
• 石英比色杯 • 调零所用溶液 • 配制标准蛋白所用溶液 • 光密度范围
制备分离胶
制备浓缩胶
装板
加样
电泳
卸板并进行凝胶染色
3. SDS-PAGE基本原理
➢ 影响迁移率的因素
➢ SDS 十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfonate )
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结 合比例为 1.4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种 蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质 分子间天然的电荷差异
二、考马斯亮蓝G-250检测法
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定 溶液中蛋白质含量的方法
原理
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙 醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应 迅速而稳。蓝色复合物在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度 成正比，因此可检测595 mn的光吸收值大小计算蛋白的含量
优点 缺点
• 一种可靠的蛋白质定量方法 • 不同蛋白质之间差别很小 • 干扰物质多 • 某些试剂不稳定
• 使蛋白质发生不可逆变性
计算方法 注意事项
• 标准曲线法
• 在加入试剂30 min后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱
• 许多干扰物质降低颜色反应 • 高盐浓度可引起沉淀
四、BCA (二喹啉甲酸检测敏感性高
缺点
•巯基试剂和去垢剂干扰 • 蛋白质发生不可逆的变性
第二节 蛋白质相对分子量测定
分子量测定 (molecular weight, MW)
质谱 (ESI-MS)
沉降平衡超速离心 排阻层析
动态弹性光散射 孔径梯度电泳
一、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量
1. 不连续系统原理 2. SDS-PAGE凝胶的制备
这是近年来新研制的一种改进的Lowry 测定法
原理
在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋ 还原成Cu＋。而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色的复合物， 在562 nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的 大小来计算蛋白质的含量
三、Lowry检测法
这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用.
原理
首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试 剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在 745 ～750 nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可 根据750 nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量
1/16 %
一、紫外光谱 (A280)吸收法
这一方法可用来快速检测溶液中是否含有 蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋 白质的洗脱峰
原理
色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm附近
大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以 测定蛋白质溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中 蛋白质含量的快速简便的方法
蛋白质的定性定量分析课件
➢ 蛋白质定性分析 (qualitative analysis)
确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质
➢ 蛋白质定量分析 (quantitative analysis)
确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量
➢ 蛋白质含量的测定方法（重点掌握） ➢ 蛋白质相对分子量测定 (SDS-PAGE) ➢ 等电聚焦电泳 (IEF)（一般了解） ➢ 蛋白质的免疫印迹分析 (western blot)
➢ 标准品的选择及处理 ➢ 待测样品的制备 ➢ 电泳分离及染色 ➢ 相对迁移率的计算
Watch SDS-PAGE操作
Analysis for SDS-PAGE electrophoresis
5. 注意事项
➢ 选择合适的胶浓度
➢ SDS与蛋白质之间的结合程度 ❖ 二硫键是否完全被还原 ❖ 溶液中SDS的浓度 ❖ 溶液的离子强度
SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具 有相同的荷质比，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子 量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈 对数线性关系
Watch SDS-PAGE原理
4. SDS-PAGE测定分子量的操作
所需时间 优点
缺点
• 10 min • 快速（反应时间仅需2 min） • 敏感，几乎没有蛋白质损失
• 对各种纯化蛋白质反应不同 • 用这种测定方法对蛋白质引起不
可逆的变性
计算方法 注意事项
• 标准曲线法
• 反应10～15 min后开始出现沉淀， 尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀
• 若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确