物种选择

致畸试验中动物的选择．除参照一般毒 性试验的原则外，还应选择孕期较短、 每窝产仔数较多、胎盘结构和代谢途径 与人类接近的动物，其自然畸形发生率 要低。一般首选大鼠．其次是小鼠或家 免。
食品安全性评价
毒性试验


急性毒性试验 局部毒性试验 蓄积毒性试验 亚慢性和慢性毒性试验 遗传毒性 生殖发育毒性
急性毒性试验

一次或24小时内多次给予受试物，了解 动物所产生的急性毒性反应极其严重程 度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原 因，观察受试物毒性反应与剂量的关系。
操作步骤

凡属我国创制的新化学物质，一般要求 进行四个阶段的试验。特别是对其中 化 学结构提示有慢性毒性或致癌作用可 能者，产量大、使用面积广、摄入机会 多者， 必需进行全部四个阶段的试验。 同时，在进行急性毒性、９０天喂养试 验和慢性毒 性（包括致癌）试验时，要 求用两种动物。

凡属与已知物质（指经过安全性评价并 允许使用者）的化学结构基本相同的 衍 生物，则可根据第一、二、三阶段试 验的结果，由有关专家进行评议，决定 是否需 要进行第四阶段试验。



健康动物的选择 性别辨认 动物称重、编号和分组 剂量设置 受试物的配制 灌胃 中毒体征和动物死亡情况观察 LD50的计算
LD50的计算方法

改进寇氏法 霍恩法 序贯法 Bliss法
改进寇氏法

是利用计量对数与死亡率呈S型曲线而设 计的方法，又称平均致死量法。本法要 求每个染毒剂量组动物数要相同，各剂 量组组距呈等比级数，死亡率呈正态分 布，最低剂量组死亡率<20%，最高剂 量组>80%。

经过长期、反复给予实验动物不同剂量 的受试物后，观察慢性毒性效应、严重 程度、靶器官和损害的可逆性。
操作步骤




分组:3-4个剂量组，1个对照组，每组40100只，雌雄各半 染毒剂量：根据亚慢性毒性试验NOAEl来 确定，以其1/5-1/2为高剂量组，1/501/10为中剂量组，1/100为低剂量组。 如无亚慢性毒性试验资料，1/10 LD50为 高剂量组，1/100 LD50为中剂量组。 实验期限：6-24个月

如评价结果允许用于食品，则制 定日许 量。凡在产品质量或试验结果方面与国 外资料或产品不一致，则应进行第三 阶 段试验。
致畸作用及试验方法

胚胎在发育过程中，由予各种原因造成 器官形态结构的异常，称为畸形具有畸 形的胚胎或胎仔，称为畸胎。凡能引起 胚胎发生畸形的化学物称为致畸物或致 畸原。化学物通过母体作用于胚胎而引 起胎儿畸形的现象称为致畸作用。广义 的致畸作用还包括引起胚胎发育迟缓、 功能不全和胚胎死亡。
结果判定


如三项试验均为阳性，则无论蓄积毒性 如何，均表示受试物很可能具有致 癌作 用，一般应予以放弃。 如其中两项试验为阳性，而又有强蓄积 性，则一般应予以放弃；如为弱蓄 积性， 则由有关专家进行评议，根据受试物的 重要性和可能摄入量等，综合权衡利 弊 再作出决定。

如其中一项试验为阳性，则再选择二项 其他致突变试验（包括枯草杆菌试 验、 体外培养淋巴细胞染色体畸变分析、果 蝇隐性致死试验、ＤＮＡ合成抑制试 验 和姐妹染色单体互换试验等）。如此 两项均为阳性，则无论蓄积毒性如何， 均应予 以放弃；如有一项为阳性，而为 弱蓄积性，需进行进一步实验进行验证 。


计算公式如下： M=Xk-i(∑p-0.5) Sm=i(∑pq/n)1/2 M:㏒ LD50 i：相邻两剂量组之对数差值 Xk：最大剂量的对数值 ；q：存活率 ∑p：各组死亡率之和; n:每组动物数
组别
1
剂量对数
1.1761 1.2561 1.3361 1.4161 1.4961
试验步骤



试验动物及分组（一般要求选择两种实 验动物，实验动物的年龄应较小，动物 数>80只） 染毒剂量（高剂量组死亡率<10%，低剂 量组不引起任何中毒反应） 染毒途径 指标观察
观察指标



一般综合指标：动物一般行为、体重摄食量变 化、中毒体征和死亡情况。 血液及生化检验：常规项目包括血红蛋白、红 细胞数、白细胞、血清酶活力等。 脏器重量：如心、肝、肺、肾等 病理学检查：试验结束时处死所有动物进行大 体尸检，如未见明显病变，可将高剂量组和对 照组的主要脏器进行病理学检查。
观察检测指标

一般观察 体重与摄食量测定 临床检查 系统尸检 恢复性观察
结果评价与应用

明确阳性指标的意义 分析评价剂量-效应-反应关系 靶器官、毒作用性质 LOAEL、 NOAEL 评价慢性毒性大小，为人群长期安全接 触水平提供依据
结果判定



小于或等于人的可能摄入量的５０倍者， 表示毒性较强，应予放弃。 大于５０倍而小于１００倍者，需由有 关专家共同评议 大于或等于１００倍者，则可考虑允许 使用于食品，并制定日许量。如在 任何 一个剂量发现有致癌作用，且有剂量反 应关系，则需由有关专家共同评议， 以 作出评价
致畸物

化学致畸物：烷化剂、反应停、激素、 孕激素、抗代谢物、甲级汞等
影响致畸作用的因素

化学物的理化性质 作用时机 剂量 遗传因素 其他因素
致畸作用机制

突变引起胚胎发育异常 化学物作用于生 殖细胞，引起遗传基因突变所产生的子 代畸形具有遗传性，作用于胚胎体细胞 引起的畸形是非遗传性的

凡属我国仿制的而又具有一定毒性的化学物质， 如多数国家已允许使用于食品 ，并有安全性证 据，或世界卫生组织已公布每人每日允许摄入 量（即ＡＤＩ，以下 简称日许量）者，同时生 产单位又能证明我国产品的理化性质、纯度和 杂质成份及 含量均与国外产品一致，则可以先 进行第一、二阶段试验。如试验结果与国外相 同 产品一致，一般不再继续进行试验，可进行 评价。

胚胎细胞代谢障碍 胚胎排除化学物的速 度比母体慢，又因胎儿缺乏肝微粒体酶， 这致使某些致畸物在胚胎或胎儿期体内 的生物转化过程与成人不同，以至于在 胚胎内蓄积、造成胚胎中间代谢障碍和 能量供应不足．影响DNA复制、细胞分 裂及组织分化过程而导致畸形

细胞毒性作用 化学致畸物进入胚胎后， 表现出细胞毒性作用，引起细胞死亡或 细胞增殖抑制，导致这些组织器官畸形
动物数
10 10 10 10 10
死亡数
0 2 5 7 9
2
3 4 5
M=Xk-i(∑p-0.5)=1.4961-0.08（2.3-0.5） 1/2 Sm=i(∑pq/n) =0.08（0.16/10+0.25/10+0.21/10+0.09/10）1/2

霍恩法


利用剂量对数与死亡率的转换数呈直线 关系而设计的方法，又称平均移动法或 剂量递增法。该法使用动物数少，可直 接查表求出LD50 。 该法推荐使用4个染毒剂量，要求每组动 物数相等，一般用4-5只动物，且剂量组 按等比级数排列。
序贯法

又称平均数法、阶梯法或上-下法，先以 一个剂量进行实验，若动物死亡，则以 下一个较小剂量试探；若动物存活，则 以较大剂量试探，依次类推，最终求出 LD50。


LD50 = (∑x f)/n n: 使用的动物总数；X：每个剂量组的剂 量 f : 每个剂量组使用动物数

举例：小鼠经口给与 某化学物染毒， 10mg/kg剂量试探， 预计使用4个剂量组， 剂量组距对数值0.2， 设计使用12只动物， 结果如下
蓄积作用的检测方法


应用化学分析或其他技术测定化学物进 入机体后在体内含量的变化过程。该方 法可确定化学的半衰期 生物学方法：即将一次染毒与多次染毒 所产生的生物学效应进行比较，故该法 所检测的蓄积性不能区分功能蓄积和物 质蓄积。
实验方法


选用大鼠或小鼠经口灌胃或腹腔注射方 法进行试验，选用至少40只动物随机分 为试验和对照组，雌雄各半。在1/201/5 LD50 以相同的染毒途径、定时定量 对试验组染毒。 当试验组累积发生一半动物死亡时终止 染毒。

另外一种测定毒物蓄积系数的实验方法 是动物每天按体重给一定剂量的毒物染 毒，第1-4天给0.1 LD50剂量，然后染毒 计量按1.5倍每4天递增一次，实验持续 20天。
蓄积系数



K=∑ LD50[n]/∑ LD50 0-1 极强蓄积 1-3 强蓄积 3-5 中等蓄积 〉5 弱蓄积 ∑ LD50：一次染毒50%的致死剂量 ∑ LD50[n]：引起50%动物死亡的累积总剂量
剂量 12.59 10.00 7.94 6.31
存活 死亡 0 2 2 1 2 3 2 0
∑x f=12.59×2+10×5+7.94×4+6.31×1 该法优点是节省动物，一般12-14只左右动物 即可完成实验。

缺点？
蓄积小剂量反复进入体内， 可表现出机体对该毒物的反应性增强， 即一次染毒不引起反应的剂量，如多次 重复染毒，则可能引起明显的反应甚至 死亡。 毒物的蓄积与进入机体的毒物剂量、重 复染毒的间隔时间、毒性及代谢特点和 机体反应特性条件有关。


虽然蓄积系数法具有一定使用价值，但 是某些化学物的慢性中毒反应无法用K表 示 例如多数有机磷化学物属于轻度蓄积， 但以小剂量反复接触后乙酰胆碱酯酶可 以持续降低，而且伴有一定程度的中枢 神经系统症状
亚慢性毒性试验

在急性毒性试验的基础上，进一步研究 多次重复染毒条件下出现的中毒体征、 生化病理改变以及可能的靶器官，确定 是否需要进行慢性试验。
蓄积类型


物质蓄积：实验动物反复多次接触化学 物后，用化学分析方法能够检测到机体 内存在该化学物或代谢产物 功能（机能）蓄积：有的化学物在长期 接触后，机体内虽不能检测到机体内存 在该化学物或代谢产物，却出现了慢性 毒性作用。