基因工程中新型表达系统
-B.subtilis 表达系统
生物工程学院 生工1005
Diagram
宿主菌株
表达载体
存在问题
工业应用
宿主菌株—枯草芽孢杆菌
• B. subtilis属革兰氏阳性菌，细胞壁仅含肽聚糖和磷壁质。 • 非致病性的重要工业微生物，其全基因组测序已经完成。人们 对其遗传背景和生理特性的了解仅次于E.coli。 • 70年代后，随着DNA重组技术的发展，金黄色葡萄球菌抗性 标记质粒的应用，该表达系统发展更为迅速。 • 成功表达了多种外源基因，广泛应用于工业生产,发现了本系 统的许多特点，同时也暴露出本系统存在蛋白酶和质粒不稳定 等问题.
芽孢杆菌表达的外源蛋白
1、耐热性酶制剂 酶系 如耐高温α-淀粉酶等淀粉加工
2、多肽类药物 如白细胞介素、人表皮生长因子 （hEGF）、胰岛素原等 3、杀虫蛋白 集素 如Bt蛋白、蛋白酶抑制剂、植物凝
很多都已经用于商业化生产 全球最大的EGF供应商—北京百胜思生物工程有限公司 中科院遗传研究所 汤懋竑教授 “汤氏芽孢杆菌基因工程系 统”
优点：相对分子质量小，有唯一的酶切位点，较高的拷贝数，
适合筛选的抗性标记
以天然质粒为基础构建：双标记质粒，穿梭质粒，探针质粒等
2、整合质粒载体 在大肠杆菌质粒载体基础上构建，含有芽孢杆菌的抗
性标记以及待整合目的基因，能通过同源重组整合到宿
主染色体上。
3、噬菌体载体
例如φ105噬菌体：温和性噬菌体、应用较多 SPβ噬菌体：原噬菌体，B .subtilis 168菌株及 其衍生菌株均带有此噬菌体。 sppl噬菌体：毒性噬菌体。
表达载体
• 结构
a. 多σ因子：迄今，在枯草杆菌中发现了10多个σ因子。
多σ因子与营养体的繁殖和芽孢形成有关，也与重叠启动 子、非重叠启动子有关。
•种类
1、自主复制质粒载体
芽孢杆菌中的质粒一般不带抗性标记，只有极少数带抗性标记，
如pBC16。 带有抗性标记的载体质粒多来自于其他革兰氏阳性菌，特别是 金黄色葡萄球菌，例如pUB110，pC194，pE194等。
优点：
• 非致病微生物，安全性高，可用于食品、药物等工业 生产。 • 能直接将分泌蛋白释放到培养基中，利于分离纯化， 优于大肠杆菌。 • 具有高效的分泌目的蛋白的能力，其分泌的真核来源 的重组蛋白多数情况下都具有天然构象和生物活性。 • 生长迅速，培养条件简单，遗传背景了解清晰，而且 有较好的工业生产基础。
B.subtilis表达系统有着较多的优点，相对于大肠杆菌 表达系统研究较少，存在问题也很多，仍需要进行大量的实 验对它的稳定性以及表达系统进行更好的了解 其优势将逐步显现，成为未来外源基因最具潜力的表达 载体。
参考文献： 《枯草芽孢杆菌表达系统的研究进展》 《枯草芽孢杆菌新型表达系统和遗传操作体系的建立和应用》 《枯草芽孢杆菌的研究与应用》
• 限制外源蛋白在枯草杆菌中高效表达的瓶颈。 • 质粒本身的不稳定性： 分离型不稳定：整个质粒丢失 结构型不稳定：质粒本身非常规重组 • 菌株特性引起的不稳定性 原噬菌体3区域中编码的基因使得重组质粒的转化 效率急剧下降，同时对外源基因有排斥性。 • 如何解决： 构建整合质粒，构建原噬菌体3区域的缺陷性菌株。
该表达系统存在的缺点：
• 分泌各种蛋白酶,会造成外源蛋白降解,有时甚至得 不到目标蛋白。
• 存在限制和修饰系统;质粒不稳定。 • 外源蛋白对细胞有毒时得不到有效的表达，有些 外源基因表达产物分泌到培养基中会影响细胞的 生长。 • 能自发形成感受态的菌株极少,感受态持续时间短 暂,分子克隆效率低
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
载体质粒的不稳定性