➢ 收集样品信息，明确分析目的和要求 ➢ 选择样品制备方法 ➢ 确定分析模式，选择相应色谱柱 ➢ 确定检测方法和条件 ➢ 优化分离条件 ➢ 方法验证 ➢ 定量分 ➢ 选择性沉淀 ➢ 萃取 ➢ 索氏抽提 ➢ 衍生化反应 ➢ 样品浓缩—旋蒸等 ➢ 新技术—加速溶剂萃取（ASE）
➢ 生化方面的分析研究 ➢ 天然产物分析研究 ➢ 药物和保健食品的分析研究 ➢ 环境检测的分析研究 ➢ 化工行业分析研究
高效液相色谱法 及其应用
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
王小云 2011-04-22
➢高效液相色谱简介 ➢高效液相色谱特点 ➢高效液相色谱分类 ➢高效液相色谱应用 ➢高效液相色谱发展
高效液相色谱简介
20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。
高效液相色谱的应用
➢ 食品工业中的应用 ➢ 在制药工业中的应用 ➢ 在环境监测中的应用 ➢ 在生物工程和生物化学中的应用 ➢ 在精细化工分析中的应用
食品工业中的应用
➢ 营养成份分析
氨基酸、碳水化合物、维生素等
➢ 食品添加剂
防腐剂、香料、保鲜剂等
➢ 有害成分
兽药残留、农药残留等
➢ 无机成份
各种无机盐
➢ 高效：分离效能高，柱效达2×103-5×104块/m。 ➢ 高灵敏度：最低可检测10-9g（ppb），痕量分析时
可达10-12g(ppt)。 ➢ 应用范围广：约80%的有机物，特别是高沸点、大
分子、热稳定性差的有机化合物。 ➢ 分析速度快：通常分析一个样品在15-30分钟，甚
至有的样品在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
➢ 醇、醛和酮、醚的分离分析 ➢ 酸和酯的分离分析 ➢ 表面活性剂的分析 ➢ 聚合物的分析研究
高效液相色谱的发展
➢ 超高效液相色谱（UPLC） ➢ 联用技术（LC-MS，LC-MS-MS)
超高效液相色谱（UPLC）
waters从上世纪60年代首推第一台液相色谱， 到70年代液相色谱商业化，至2004年UPLC系统 推出，一直是行业领导者。
能分别给出各组分的色谱图来进行定性定量； ➢ 定性分析结果可靠。可以同时给出每一个组分
的分子量和丰富的结构信息； ➢ MS具备高灵敏度。检测能力提高一个数量级
以上； ➢ 分析时间快。LC-MS使用的液相色谱柱为窄
径柱，缩短了分析时间，提高了分离效果； ➢ 自动化程度高，LC-MS具有高度的自动化。
液质联用应用领域
UPLC的特点
➢ 超强分离能力（1.7um颗粒） ➢ 超高速度（压力可达105MPa） ➢ 超高灵敏度 ➢ 简便方便的方法转换 ➢ 快速自动进样（采用针内针） ➢ 最佳的质谱接入口
UPLC的特点及应用
➢ UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是 HPLC的9倍、3倍及1.7倍
➢ UPLC主要应用于代谢组织学分析、环境监 测及其他一些生化领域，包括天然产物的 分析 。特别是中药研究领域的发展是一个 极大的促进。
➢ UPLC是HPLC的未来
高效液相-质谱联用（LC-MS）
色谱的优势在于分离， 质谱能够提供物质的分 子量及结构信息。液质 联用体现了色谱和质谱 优势的互补，将色谱对 复杂样品的高分离能力， 与MS具有高选择性、高 灵敏度及能够提供相对 分子质量与结构信息的 优点结合起来。
LC-MS特点
➢ 分析范围广 ➢ 分离能力强。通过MS的特征离子质量色谱图
生的工业废水）
在生物工程和生物化学中的应用
➢ 氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究 ➢ 核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 ➢ 生物胺的分析研究 ➢ 变性高效液相色谱检测法（DHPLC）是近
年来发展起来的一项相对较新的技术，主要 应用于基因突变分析中，能够满足大规模的 基因变异检测筛查。
在精细化工分析中的应用
高效液相色谱法局限性
➢ 成本高 ➢ 易污染环境 ➢ 缺少通用型检测器 ➢ 不能代替气相色谱，无法完成柱效高达10
万块理论塔板数的分析 ➢ 不能代替中低压柱色谱法
高效液相色谱分类
按分离原理分类：
➢ 吸附色谱法 ➢ 分配色谱法 ➢ 离子交换色谱法 ➢ 体积排阻色谱法
正相色谱 反相色谱
高效液相分析方法的建立
经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸色 谱。 20世纪60年代末：
随着色谱理论的发展、高效细微固定相 的开发、高压恒流泵及高灵敏度检测器的应用， 高效液相色谱法得到了突破性的发展。
高效液相色谱的特点
（三高一广一快）
➢ 高压：流动相流经色谱柱时，受阻力较大，为了迅 速通过色谱柱，必须对流动相加高压。
在制药工业中的应用
➢ 药物鉴别 如：青霉素中有效成份可用反相色谱法分离
➢ 杂质检测（原料、中间体、副产物等） ➢ 含量测定 ➢ 手性分离 ➢ 药物代谢动力学研究、临床血药浓度等检测
中应用非常广泛
在环境监测中的应用
➢ 多环芳烃的检测（有机燃料未完全燃烧产生） ➢ 多氯联苯（PCB）的检测 ➢ 农药残留的检测（有机磷、氯、除草剂等） ➢ 酚类和胺类的检测（化工、燃料、制药等产