缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA）探 针检测RNA样品。 主要检测插入片断
是否被转录。
从宿主细胞中提取RNA， 再用探针杂交。
第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”
利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且 表达出相应的蛋白质的外源基因。
（3）环丝氨酸：
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基 因失活，可用四环素+环丝氨酸平板培养基选
择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨
酸杀死，保留下来；
Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而
第七章 重组体克隆的筛选和鉴定
转化子与筛选的概念
转化子(transformant)：导入外源DNA后获得了新
的遗传标志的细菌细胞或其它受体细胞。
筛选(screening)：将重组体的转化子细胞或转染噬 菌体群体从其它细胞群体中分离出来，并要鉴定 无性繁殖的外源基因确实为目的基因的过程。
筛选方法的类型
2. 选择过程
-半乳糖苷酶使X-gal分解成兰色产物。
第二节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。
一、原理： 1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突 变型缺陷。
受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在
受体细胞表达情况的不同，分为：
1. 直接筛选 针对载体携带某种或某些选择标记基因（selectable marker genes）、报告基因（reporter gene）或目的 基因而设计的筛选方法。 特点：直接测定基因或基因类型
2. 间接筛选
不要直接鉴定基因，而是利用其它方式， 例如利用特异抗体与目的基因表达产物相 互作用，进行对重组体的筛选。
加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗
掉。二抗只识别一抗。
二抗
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、 脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应
转变成有色物质（或发光）。
（5）比色 在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。
四、免疫印迹（western blotting）法
mRNA DNA
核糖体 小亚基
核糖体 大亚基
能翻译
不能翻译
2. 过程
四、杂交释放转译法
1. 原理：
在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的
mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的
mRNA，进行体外转录。
研究其转录产物的性质是否是预期的基因产
物（如分子量、免疫源性等）。
2. 过程
硝酸纤 载体和插 维素滤膜 入的cDNA
一抗 二抗 辣根过氧 化物酶 底物 产物， 并发出光
辣根过氧化物酶：HRPO
底片曝光
③ Blotting过程
1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。
2）洗去未结合的一抗。
3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。 Immuno Blotting
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
1.原理： （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）： ① SDS: 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性 状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis）

不依赖于外界压力的一类基因。把它的编码序列 与目的基因融合表达后，可通过报告基因产物的 表达来“报告”目的基因的表达调控，是细胞和 组织内监测基因表达与蛋白定位的理想标记。
报告基因

β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase)基因 荧光素酶(luciferase)基因 氯霉素乙酰转移酶(chioramphenicol acetyltransferase)基因 β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)基因 胭脂碱合成酶(nopaline synthetase,nos)基因 章鱼碱合成酶(octopine synthetase,ocs)基因 乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthetase)基因 苏氨酸脱水酶(threonine dehydratase)基因 绿色荧光蛋白质(green fluorescent protein)基因

主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。 它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转化成功与 否 。 培养在含有抗菌素或除草剂的选择培养基上的非转化细胞， 便被杀死或是生长受到抑制，而转化细胞则能够存活下来， 得到正确选择和鉴定。

选择标记基因
a.抗菌素抗性基因：

新霉素(neomycin) 磷酸转移酶基因潮霉素(hygromycin)
与外源DNA插入片断互补的序列。 重组克隆与探针杂交。
3. 识别标记 （1）放射性同位素 （2）非放射性标记
32P 或 125I
。
荧光素
二、核酸杂交检测方法 1. Southern blotting
①用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。
②从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），
再用探针杂交。
③只有带有插入片断的重组载体才能与
一般克隆与筛选策略

第一节
载体表型选择法
第二节
第三节
根据插入基因的表型选择
DNA电泳检测法
第四节
第五节 第六节 第七节
核酸杂交检测法
免疫化学检测法 转译筛选法 几种常见的真核生物重要基因选择方法
第一节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法 1. 原理：
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I
标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。
1. 原理 2. 方法 把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入 基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，
抗原——抗体凝集反应。
就会与抗体反应形成“沉淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位 溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
被环丝氨酸杀死。
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗
性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖
-半乳糖苷酶
半乳糖 半乳糖
+ +
葡萄糖
X-gal
5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
1. 原理：
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z） 的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位 点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因 （ 片段缺失）。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功 能的-半乳糖苷酶。
三、PCR扩增检测法 1. 原理
PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。
2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。
（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
第四节 核酸杂交检测法
一、原理： 1. 核酸杂交 2. 检测用的探针
在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝
胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于
其分子量大小（链的长短），从而把不同分子
量的肽链分开。
Da ③蛋白质电泳的分子量标准 已知分子量的蛋白质混合液。 氨基酸平均分子量：
110Da 道尔顿(质量单位, 等于一氧
原子质量的十六分之一。 一克约为6×1023道尔顿
凝胶放射自显影
总mRNA 杂交
cDNA编 码的蛋白
硝酸纤 载体和插 cDNA基因的 维素滤膜 入的cDNA mRNA
电泳 cDNA编 码的蛋白
洗脱
硝酸纤 载体和插 维素滤膜 入的cDNA
cDNA基因的 mRNA
体外翻译
收集
35S标记的氨基酸
第七节
植物转化体报道基因筛选法
选择基因，指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所 不具备的新的遗传特性，从而使得人们能够使用 特定的选择培养基，将转化的新细胞从亲本细胞 群体中选择出来的一类特殊的基因。
④结果 单抗blotting 结果
多克隆抗体 Blotting的 结果
第六节 转译筛选法
借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载 体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。 一、无细胞翻译系统 能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。
如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。
二、转译筛选
一、放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式
根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性 质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜 固相支 持滤膜 固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
一抗
待测基因 二抗 产物蛋白 一抗
125I
标记的二 抗结合蛋白
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。