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重组体的选择与鉴定1


间接选择法
依赖于重组子结构特征分析的筛选法
快速裂 限制性 菌落杂 解菌落 内切酶 PCR法 交筛选 鉴定分 酶切法 子大小
依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一 快速裂解菌落鉴定分子大小
基本原理:
由于外源片段插入的重组质粒与载体 大小不同,故可以利用琼脂糖凝胶电泳将 重组体分离出来。
依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一 快速裂解菌落鉴定分子大小
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法二析的筛选方法三 PCR法 基本原理:
在载体DNA分子中,外源DNA插入位 点两侧的序列多为已知,通过与插入位点 两侧已知序列互补的引物,从单克隆中提 取少量质粒 DNA 作为模板进行 PCR 扩增, 琼脂糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。
抗药性基因失活
抗药性基因失活
注意事项:
( 1 )以 Amp 、 Tc 等抗生素作为选择药物时, 37℃培养时间约 12~16h ,超过时间视为杂 菌(假转化子菌落)。 ( 2 )挑选单菌落作为转化子以便进一步实验 验证。挑的菌落在培养基中震荡培养。
遗传学表型筛选方法二 β -半乳糖苷酶显色法
用体外标记基因 DNA 或相应的 RNA 为探针同转 化后的菌落进行原位杂交,筛选含重组DNA的克隆。 这个方法可以快速地从数百个菌落中挑选出含有重组 DNA的克隆。 该方法的优点是通用性比较强,可以用来检测任 何一种插入的DNA序列。这种方法依据的是核酸分子 杂交的原理,而不以插入的DNA序列能否实现基因表 达为前提,因此,只要有可利用的标记探针就可检测 出重组质粒DNA。
基本原理:
许多质粒载体具有β -半乳糖苷酶显色反应的检测功能。 当外源 DNA 插入到它的 lacZ 基因(编码 β - 半乳糖苷酶) 上时,可造成β -半乳糖苷酶的失活,就可通过大肠杆菌转化 子菌落在添加 X-gal-IPTG 培养基中的颜色变化鉴别出重组子 和非重组子。(X-gal是β -半乳糖苷酶的显色底物)
抗药性基因失活
例如:
非重组的 pBR322 质粒 DNA 上的四环素和氨 苄青霉素抗性基因都是正常的。带有这种质粒的 受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性 平板上生长。但是, 如果在该质粒的氨苄青霉素抗 性基因内插入外源片段 , 就会造成氨苄青霉素抗 性基因失活, 携带这种质粒的宿主菌可以在四环素 的平板上生长 , 而不能在氨苄青霉素抗性平板上 生长。
遗传学表型筛选方法二 β -半乳糖苷酶显色法
遗传学表型筛选方法二 β -半乳糖苷酶显色法
注意事项:
(1)由于被转化的基因产物作用于X-gal需 要较长 时间,因此,观察和确定转化子菌 落的培养时间可适当延长。与37℃温箱取 出后放4 ℃冰箱几小时后观察效果更好; (2)为了防止假阳性需挑菌进一步验证。
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR法 注意事项:
• 如需检测插入片段及其方向,则使用 载体特异引物和方向插入特异引物或互换。 如只需确认是否存在插入片段,可用 2 个 插入片段特异引物。 • 扩增反应前在 94℃变性两分钟,有 利于细菌的裂解,提高PCR产物扩增的成 功。
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法四 菌落杂交筛选 主要原理
氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(Cm) 卡那霉素(Kan)、四环素(Tet或Tc) 链霉素(Sm或Str)
抗药性基因不失活
基本原理:
外源基因片段插入载体的位点在抗药性 基之外, 不导致抗药性基因的失活,仍能编 码抗药性基因产物。含有这种重组子的转化 细胞可以在含有相应抗生素的琼脂平板上生 长成菌落,未能接受载体DNA的细胞因不能 生长而被排除。
优点:直观快捷, 适用于插入片段较 大的重组子的筛选。 缺点:不能鉴别插 入片段大小相近的 非目的基因片段。
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法二 ——限制性内切酶酶切法 基本原理:
根据已知的外源DNA序列的限制酶切图 谱,选择一两种内切酶切割质粒,电泳后比 较电泳结果(DNA的带数和长度)。或用合 适的内切酶酶切插入片段,再用其它酶酶切 这个片段,电泳后比较电泳结果是否符合预 计的结果。



重组子的筛选往往需要几种方法综合起来, 仅用一种方法可能不能很好的筛选出我们所需的 重组体。一般先用直接筛选法初步筛选,再用间 接法筛选进一步筛选。
例如: 实验中常先利用抗药性进行初步筛选,再进 行电泳检测,最后甚至会去测序,确定重组子已 插入。
常用的选择方法
直接选择法
抗药性筛选 限制性内切酶酶切法 β -半乳糖苷酶 显色法 PCR法 菌落杂交筛选
间接选择法
快速裂解菌落鉴定分子大小
直接选择法
抗药性筛选
依赖于遗传表型 的选择法 β -半乳糖苷酶显色法
遗传学表型筛选方法一—抗药性筛选
分类:
(1)抗药性基因不失活 (2)抗药性基因失活
常用的抗药性选择标记:
抗药性基因不失活
实验步骤:
(1)培养基中加入千分之一的抗性药物,再倒平板; (2)将转化后的菌液均匀涂布在平板上; (3)放在37℃培养箱培养12~16小时; (4)观察菌落生长情况。
抗药性基因不失活
抗药性基因失活
基本原理:
如果外源基因片段插入载体的位点在 抗药性基因中 间,导致抗药性基因失活, 这个抗药性标志就会失活。检测外源DNA 插入作用的一种通用的方法是插入失活效 应。
遗传学表型筛选方法二 β -半乳糖苷酶显色法
举例:
pUC质粒:带有β -半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序 列和β -半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个
编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位点
的多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架。 大肠杆菌菌株:带有β -半乳糖苷酶C端部分序列的 编码信息。 在各自独立的情况下,pUC质粒和大肠杆菌编码的β -
半乳糖苷酶片段都没有活性。
遗传学表型筛选方法二 β -半乳糖苷酶显色法
当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的 蛋白质,它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(异丙 基-β -D-硫代半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外 源片段插入到pUC质粒的多克隆位点上后,则会导 致读码框架改变,表达蛋白失活,因此,在同样条 件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能 形成白色菌落。因此,根据这种β -半乳糖苷酶的 显色反应,可将重组质粒与自身环化的载体DNA分 开。
• 载体和一个或数个串联目的基因连接 • 载体发生自连 • 目的DNA分子发生自连
• 未发生连接反应的载体和目的DNA片段
为什么要对重组子进行选择与鉴定
因此 , 在成千上万个转化子中,真正含 有期望的重组 DNA 分子的比例很少,为了将 含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA的宿 主细胞分开,以及将含有正确重组子的宿主 细胞和含有其他外源 DNA 的宿主细胞分开, 就需要设计出最易于筛选重组子的方案并加 以验证。
重组体分子的选择与鉴定方法及原理
何为重组体?
转化子:在 DNA 分子克隆中,通常将导入外
源 DNA 分子后能稳定存在的受体细胞称为
转化子;
重组体:含有重组DNA分子的转化子; 目的重组体:含有外源目的基因的重组体。
为什么要对重组子进行选择与鉴定
在转化反应中 , 并非所有的细胞中都转入 重组DNA分子,即使所有的受体细胞都变为转化 体 , 所获得的转化子仍是多种类型的 DNA 分子 , 因为在连接反应中会有以下几种情况发生:
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