第六节 重组体克隆的筛选和鉴定
转化子和重组子
转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存 在的受体细胞称为转化子
重组子：含有重组DNA分子的转化子成为 重组子。 如果重组子中含有外源目的基因则又称为 阳性克隆子或期望克隆子
选择 (selection) 筛选 (screening)
选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用， 呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方 法。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 含bla基因的菌体产生-内酰胺酶，使氨苄青 霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数或没有终 止密码；（不破坏肽）。
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
第二小节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道 重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在cDNA文 库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这 时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。
第一小节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
例：
降解
小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长)有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三小节 DNA电泳检测法
BioPesticide Engineering
Hezhong Wang (Ph.D.)
Department Head / Director Department of Pesticide / NanoAgro Center
Henan Agricultural University Email: hezhongw@ Office: Bldg 35# Room 409
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
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第四小节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交定克隆过程
由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很 少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使 用高度敏感和高度特异的筛选方法。
根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法 也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛 选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体 时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备 明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进 行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提 取其中的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以 准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源 片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
▪ 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 ▪ 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），
再用探针杂交。 ▪ 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程