色的底物转变为有色的物质（或发光），再 通过比色测定有色物质的含量（或光强度）， 从而推测目标分子的含量。
待测基因 产物蛋白
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察 19
2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板 （microtiter plate）的孔中，干燥后 就被固定在孔底。
只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
（1）原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并 且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法
第四节 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒 载体），再用探针杂交。
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。
1. 原理 抗原——抗体凝集反应。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉 淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。
二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）按照外源DNA插入片断设计引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
电泳检测法、酶切法、ＰＣＲ法凝胶电泳检测
DNA Marker
加 样
空质粒 重组质粒
孔
重组质粒酶切
凝胶电泳检测
重组质粒的PCR 结果。
3.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）
临床检验常用的单抗
④结果 单抗blotting 结果
多克隆抗体 Blotting的 结果
第二节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
第三节 PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为 青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
一般克隆与筛选策略
Xgal----(5-溴-4-氢-３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷)
ß-半乳糖苷酶法
Am
lacZ
N2H
片段
β片段
COOH
X-gal
Lac Z
蓝色化合物
X-gal
（LacZ基因 N端序列）
LacZ基因 N端序列
LacZ酶
插入片段 （LacZ基因失活）
2. 选择过程
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
第六章 重组体克隆的筛选和鉴定
17
大 肠 杆 菌
第一节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法 1. 原理：
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
孔底
（2）一抗结合 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗
（3）二抗结合 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二 抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物 酶、脲酶等）。
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催 化反应转变成有色物质（或发光）。
（5）比色
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
1. 原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组 可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。