操作
• 离心机分类：普通 6000rpm 高速 20000-25000rpm 20000超速 30000-80000rpm 30000• 平衡 • 温度-离心力-转速 温度-离心力• 转头：角转，平转，垂直转
三 凝胶电泳技术
原理
• 等电点：DNA pI=6.0-7.0 等电点：DNA pI=6.0• 琼脂糖-PAG：支持介质 琼脂糖-PAG：支持介质 • U=V/E=（d/t）/（v/l） U=V/E=（d/t） v/l） =Q/(6 π rη)
电泳影响因素
• 1. DNA物理性质 DNA物理性质
质粒： CC＞L ＞OC CC＞ 线பைடு நூலகம்：㏒10M 正比 1/m
• 2. 介质性质
㏒10U= ㏒10U0-KrT 分离范围：agrose：100bp分离范围：agrose：100bp-60kb PAG： PAG：5-500bp
• 3. 电压：5v/cm 电压：5v/cm • 4. 缓冲液：TAE，TBE，TPE 缓冲液：TAE，TBE，
方法
样品+ 样品+等体积饱和苯酚 10kb以上轻柔混匀；10kb以下振荡 10kb以上轻柔混匀；10kb以下振荡 离心（12000*g） 离心（12000*g） 取上清
核酸相 Protein变性相 Protein变性相 有机相
二 离心技术
原理
• 离心力：F= ω 2rm 离心力：F= RCF=F/G= ω 2r/g =（2π * rpm）2r/g rpm） =1.119*10-5(rpm)2r • 浮力密度：K=m-mp0/p 浮力密度：K=m• 沉降阻力：f*(dx/dt) 沉降阻力：f*(dx/dt) • RCF=k+ f*(dx/dt) 差速离心— 差速离心—密度梯度离心
任
务
• 采集植物叶片 • 1. 植物的科, 种, 属 植物的科, • 2. 取幼嫩叶片0.8克(中午) 取幼嫩叶片0.8克 中午) • 3. 清洗干净, 擦干水分!? 清洗干净, 擦干水分!?
结构类结构类-细胞碎片，细胞器，其他 大分子-DNA，RNA，Protein，糖类，脂类等 大分子-DNA，RNA，Protein，糖类，脂类等 小分子小分子-氨基酸，小分子糖类和脂类，水，无机物等 • 2. 关键: DNA，RNA—Protein 关键: DNA，RNA—
• 3. 方案： Protein变性 Protein变性
• 纯度：OD260/OD280=1.6-1.8 =1.6-
五 分子杂交技术
六 序列分析技术
作业
• 1. 市售苯酚为什么要饱和与重蒸？ • 2. 离心操作应该注意哪些问题？ • 3. 如果要分离470bp和5kb DNA 应该选择 如果要分离470bp和 什么凝胶？ • 4. 在核DNA定量时，取10uL DNA待测液， 在核DNA定量时，取10uL DNA待测液， 用TE buffer 稀释到100uL 后，加入到 稀释到100uL 0.5cm的石英比色皿中。OD 测定为0.21， 0.5cm的石英比色皿中。OD260测定为0.21， 问DNA待测液的浓度是多少？ DNA待测液的浓度是多少？ • 5. 简述DNA序列分析的基本原理。 简述DNA序列分析的基本原理。
苯酚：强变性 25 氯仿：弱变性 24 异戊醇：消泡 1
• 4. 苯酚的处理：重蒸-饱和-pH 苯酚的处理：重蒸-饱和重蒸：去除醌类氧化物 饱和：防止核酸损耗 pH： pH7.0-8.0-核酸最适合 pH： pH7.0-8.0方法：蒸馏（183℃ 收集（棕色瓶）方法：蒸馏（183℃）-收集（棕色瓶）-饱和与调 pH（Tris-HCl pH8.0）-0.1%8羟基喹啉- 4 ℃或pH（TrispH8.0） 0.1%8羟基喹啉20 ℃保存
四 核酸定量技术
原理
• A= ㏒10（1/T） 10（1/T）
= abc
• 浓度：稀溶液（A-0.05-1.0）+ b=1cm 稀溶液（A 0.05-1.0）
DNA： DNA：1OD260=0.05ug/ul RNA： RNA：1OD260=0.04ug/ul dsDNA： dsDNA：1OD260=0.033ug/ul
实验基本技术
分子生物学部分
存在问题
• 1. 基本的实验技能 • 2. 实验习惯 • 3. 责任感和安全性
• • • • • • •
核酸纯化技术 离心分离技术 凝胶电泳技术 核酸定量技术 分子杂交技术 序列分析技术 ………………
一 核酸纯化技术
原理
• 1. 核酸混合物成分: 核酸混合物成分: