我们仅讲其中部分内容：
液相色谱仪器系统及应用
HPLC硬件基础知识 日常应用注意事项
液相系统维护流程图
线路过滤器
单向阀
色谱柱 柱塞密封圈 手动进样器
检测器
吸滤头
5大系统：
（1）输液系统； （4）检测系统；
（2）进样系统； （5）数据处理系统；
（3）分离系统；
输液系统
接头
不锈钢接头 / 垫圈 主要用于输液泵、进样器的连接 – 能承受 400 kgf/cm2压力
内容简介
色谱发展概况 色谱分离原理 色谱基本理论 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据输出系统 色谱方法的选择 色谱条件的优化 案例分析 化学因素 机械因素
§1 液相色谱基本概念
§2 液相色谱仪器系统及应用
§3 液相色谱方法开发和优化
§4 液相色谱常见问题及其解决方法
• “ k’ ”是比“ tR”还常用的保留值，它与柱子的大小及流速无关，只与溶 质在固定相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比（即固定相和流动相 之体积比）有关。“ k’ ”又定义为在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之 比，消除了保留值的波动因素，而分配系数“ K ”是平衡时物质在两相中 的浓度比。
• k’值的范围：0.4＜k’＜20～30； k’＝2～5为佳，过大则耗时太长。
气相GC中B=2rDm中Dm比HPLC中大105倍
在HPLC中第二项可忽略，故高效液相色谱的范氏方程为：
H = A + Cμ
2.6 µm
2.6 µm
扩散
A = 涡流扩散－多径扩散
仔细填充柱子 使用粒径均一的载体
H E T P A
初始 带宽
最终 带宽
线速度
mAU
3 µm and 580µm particles
不能直接用有机溶剂 冲洗缓冲盐溶液
流动相的更换
不互溶的流动相不能直接更换 缓冲盐不能直接用有机溶剂更换
水
缓冲盐
异丙醇
水
正己烷
有机溶剂
溶剂前处理
过滤：0.45um或更小孔径滤膜
目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱， 尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸， 不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂
柱效率（热力学）：
• 定义： 理论塔板数 (
tR N＝
2
柱效
)：
1/2 h 2ơ
每米柱效
ơ—标准偏差，曲线拐点处峰宽的一半， 即峰高0.607处峰宽的一半。 为便于测量，改用半峰宽： W1/2( 或2×△t1/2 ) H 最常用的计算式：
tR N＝5.54 W 1/ 2
H E T P
5 µm
线速度
5
w1/2
6
3 µm
mAU
w1/2
5 6
3
80
4
60
流动相
40
20
滞流的 流动相
0 1 2
Sub-2 µm
3 4 5 6
w1/2
固定相
0
扩散
The Van Deemter Equation
A = 涡流扩散－多径扩散 B = 自由分子扩散 C = 传质阻力 HETP
B u
吸滤头
材料：不锈钢(或陶瓷)烧结，孔径10um
故障：堵塞
表现：管路中不断有气泡生成 措施：用异丙醇（或5％稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水 清洗
Need Not Be Greater Than 1.2
不同分离度比较
Poor efficiency Moderate selectivity R=1
Poor efficiency Good selectivity
R = 1.5
Excellent efficiency Poor selectivity R = 0.5
色谱起源
M. S. Tswett 1906年，俄国植物学家M.S. Tswett 命名这种应用吸附原理分离物质的新方 法为色谱(Chromatography)； 1952年，James和Matrin发明了气 相色谱法；
60年代末，高效液相色谱（HPLC） 崛起； 21世纪，超高压色谱、多维色谱等出现 使得色谱技术进入了飞速发展阶段；
缓冲盐
常用代表性的弱酸的pKa值
pK1 醋酸 柠檬酸 磷酸 4.87 3.13 2.16 4.76 7.21 6.40 12.32 pK2 pK3
缓冲液
缓冲液的使用
使用前必须过滤 使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:
用含5%甲醇的水溶液冲洗30min（1ml/min），再用甲醇 冲洗30min 用纯水冲洗泵头清洗管路 易受到细菌和霉菌的影响
Analyst, Talanta, Journal of Separation Science, Recent Patents on Nanotechnology,Separation Science & Technology, Current Pharmaceutical Analysis,《环境化学》 等国内外知名刊物评
色谱研究方向
• 高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 气相色谱 Gas Chromatography (GC) 薄层色谱 Thin-Layer Chromatography (TLC) 凝胶电泳 Gel Electrophoresis(GE) 毛细管电泳 Capillary Electrophoresis(CE) 毛细管电色谱 Capillary Electrochromatography(CEC)
60
Sub-2 µm particles
40
20
w1/2
6
w1/2
0
5
0
1
tR
7
2
3
4
5
tR
6
7
Dispersion due to eddy diffusion or multi-path effect
扩散
在液相中影响小 在低流速中影响大 B = 自由分子扩散－纵向扩散
Zero linear velocity
流动相
• 溶剂的等级 – HPLC级 – 优级纯 – 分析纯
微量分析、梯度洗脱
都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒） 优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质
有机溶剂的等级
• 分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图
Excellent efficiency Moderate selectivity
R=4
•
（ 1）
分配系数
KA≠KB 或k’A≠k’B 是色谱分离的前提!
• （2）容量因子“k’”：
t R－t0 , • k '＝ 溶质在固定相中的量 或： k＝ 溶质在流动相中的量 t0 •
k’
k’ k’β
思考：为什么要优 化流动相比例？
液相色谱分离原理
吸附：物质在两相界面上浓集的现象
色谱法的分离原理：溶于流动相(mobile phase)中的 各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子交换、排阻、 亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不 同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层 析法。
主持科研项目：
1.国家自然科学基金 2.教育部博士点（新教师类）基金 3.中国博士后基金 4.福建省自然科学基金 5.福建省教育厅基金 6.校科技发展基金
审人。目前，已在国际权威刊物上发表 SCI论文20多篇，申请国家发明2项。 目前已发表SCI论文二十余篇，代表性论文：
(1) Anal.Chem, 2006,78,5322-5328(IF=5.9); (2)J.Chromatogr.A, 2007,1170,118-121.(IF=4.2) (3)J.Chromatogr.A, 2009,1216,8612-8622.(IF=4.2); (4) J. Mater. Chem., 2011,21,518-524. (IF=5.1) (5)J.Chromatogr.A, 2010, 1217, 4507-4510.(IF=4.2); (6)mun., 2011,47, 9675-9677.(IF=5.8) ;
垫圈
– 一旦固定，垫圈不可再动
PEEK接头
不锈钢接头
主要用于色谱柱、检测器的连接
– 易于安装 – 能承受 250 kgf/cm2压力
– 容易产生死体积
PEEK接头
死体积
• 死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题.
公螺母
死体积
管线
好的连接
差的连接
流动相
选择原则 • 采用 “HPLC” 级溶剂 • 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 • 对试样有适宜的溶解度 • 溶剂粘度要小 • 与检测器相匹配
H E T P
B

3
w1/2
线速度
4
Very low linear velocity
mAU 80
5
6
tR
60
40
20
w1/2
0 1
0
At or above optimum linear velocity
2
3
4
5
tR
6