第二章基因工程工具酶一、解释下列名词1.Restriction and modification（限制与修饰）宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends(or cohesive end)（匹配末端或粘性末端）识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Star activity星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
5. Klenow fragment Klenow 片段。
Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段，而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。
6.Reverse transcriptase反转录酶。
即依赖于RNA 的DNA 聚合酶，它有5'--3' 合成DNA 活性，但是无3'--5' 外切活性。
7.Terminal transferase（末端转移酶）8.Ligase连接酶。
催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。
9.T4 polynucleotide kinase（T4多聚核苷酸激酶）催化ATP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。
10.Alkaline phosphatase（碱性磷酸酶）催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸11.S1 nuclease Sl 核酸酶。
可降解单链DNA 或RNA ，产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链；对dsDNA ，dsRNA ，DNA:RNA 杂交体不敏感。
二、填空题1.限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）的命名是按属名和种名相结合的原则的，通常第一个大写字母取自（属名的第一个字母），第二、三个字母取自（种名的前两个字母），第四个字母则用（菌株名）表示。
2.Ⅱ型限制酶识别回文对称序列，在回文序列（内部）或（附近）切割DNA，产生带3'－OH和5'－P基团的DNA的产物，需（Mg2＋）的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM。
3. 识别相同序列的限制酶称（同裂酶）4.DNA载体经HindⅢ切割后产生粘性末端，能发生载体自连，影响载体与外源DNA的连接效率，常用的防止载体自连的方法有（去磷酸化）、（部分补平）。
5.完全的回文序列应具备两个特点即（能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对）和（两条互补链的5'--3' 的序列组成相同，即将一条链旋转180°，则两条链重叠）。
6.限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）通常保存在（50%）浓度的甘油溶液中。
7.载体和外源DNA经酶切，在进行下一步操作前，需消除限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）的影响。
常用的方法有（EDTA 法）、（加热法）、（苯酚抽提法）、（试剂盒除酶法）。
8.对DNA进行双酶切时，酶切缓冲液的选择原则有(1)（）、(2)（）、(3)（）9. Klenow DNA聚合酶是E.coli DNA polymerase经蛋白酶裂解而从全酶中除去( ) 活性的多肽大片断，而其他活性保持不变。
10. E.coli DNA连接酶与T4 DNA连接酶相似，但需（）的参与。
11. T4多核苷酸激酶在高浓度的ATP时发挥最佳活性，（）是其强烈抑制剂。
三、选择题：从备选答案中选出正确的结果，正确答案是唯一的。
1.限制性内切酶一般保存在（C）浓度的甘油溶液中。
A 10%B 20%C 50%D 60%2.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶（C）A. 既可以作用于双链DNA，又可以作用于单链DNAB. 只能作用于单链DNAC. 只能作用于双链DNAD. 只能作用于RNA3.已知某一内切酶在一个环状DNA上有4个切点，当用此酶切割该环状DNA，可以得到（B）个片段A. 3B.4C.5D. 64.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶星星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在（A）以下A. 5%B. 10%C. 20%D. 30%5.在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制哪一项最好（D）A. 反应体积错误！未找到引用源。
B. 酶反应温度C. 反应时间D.酶量6.下列试剂中，哪一种可以螯合Ca2＋离子（）A. EDTAB. 柠檬酸钠C. SDSD. EGTA7.DNA被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因中，哪一项不太可能（C）A. 蛋白质（如BSA）同DNA结合B. 有外切核酸酶污染C. 酶失活D. 酶切条件不适合8. nick与gap的区别在于（A）A. 前者是断开了一个磷酸二酯键，后者是指DNA的单链中有较小的缺失B. 前者是是指DNA的单链中有较小的缺失，后者是指断开了一个磷酸二酯键C. 二者无本质区别D. 前者无法回复，后者可9.Klenow 酶与DNA聚合酶相比，前者丧失了（）活性A. 5'--3'外切酶B. 5'--3'合成酶C. 转移酶D. 3'--5'外切酶10.限制酶的命名遵循一定的原则，涉及来源（宿主），菌株或生物型。
命名时（A）A. 属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）B. 种名第一字母，属名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）C. 属名第一字母，亚种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）D. 种名第一字母，亚种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）11.以下对同裂酶的描述中，哪一项是正确的（A）A. 识别相同序列的限制酶称同裂酶B. 可以产生相同的粘性突出末端的限制酶称同裂酶C. 同裂酶的切割位点一定相同D. 同裂酶的切割位点不相同12 .BAP与CIAP的区别在于（）A. BAP 68℃时失活，而CIAP 68℃稳定B. CIAP 68℃时失活，而BAP 68℃稳定C. 二者均耐酚抽D. 二者均不耐酚抽13.下列哪一种酶作用时需要引物（B）A. 末端转移酶B. 反转录酶C. DNA连接酶D. 限制酶14.限制性内切核酸酶可以特异性地识别（C）A. 特定的三联密码B. 双链DNA的特定碱基对C. 双链DNA的特定碱基序列D. 单链DNA的特定碱基序列15.DNA连接酶在体内的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，下列对DNA连接酶的描述中，那项是正确的（A）A. 将双链DNA分子中的5'磷酸基团同3'－OH末端重新形成磷酸二酯键B. 作用时不消耗能量C. 需要Mn2+等二价辅助离子D. 也可以是RNA分子16.下列酶中，除（）外都具有磷酸酶的活性A. BamHⅠB. CIAPC. 单核苷酸激酶D. BAP四、简答题1.简述限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）的概念及其生物学功能？定义：指识别DNA 的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA 的一类内切酶。
生物学功能：保护宿主不受外来DNA 分子的感染，可降解外来的DNA 分子，从而阻止其复制和整合到细胞中2.PCR引物设计引入酶切位点时，为什么需在酶切位点后加上一些碱基？限制酶切割DNA 时对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。
因此，一般需在设计引物时在限制酶切位点外另加3～4 个碱基。
3.试回答影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素？外因：反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶本身的活性；内因：位点偏爱性；甲基化；底物的构象。
4.在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？5.何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。
引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（>100U/ml）；③低离子强度（<25mM）；④高pH (>8.0)；⑤有机溶剂如PMSD （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）和sulphalane 等；⑥用其它二价阳离子Mn2+、Cu2+、Co2+ 或Zn2+ 代替Mg2+ 。
星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100～150mM （在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH 至7.0 ；⑤使用Mg2+ 作为二价阳离子。
6.某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？生物体内的DNA 序列可能是经过甲基化修饰的，而在体外合成时，缺乏这种修饰作用。
当用依赖于甲基化的限制酶DpnI 来切割非甲基化的序列时，就会出现不能切割的情况。
7.天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。
试问在此过程中如何增减酶切位点？在酶切水平上，通过酶切和连接产生新的酶切位点。
①将产生的5' 突出端补平后，再连接以产生新的酶切位点；②同尾末端的连接，不同的同尾酶切割DNA 产生的末端，再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点却消失；③平末端的连接8.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，具有3'--5’外切活性和5'--3'的聚合酶活性以及5'--3'的外切活性，试根据此推测该聚合酶可能具有哪些用途?9.BAP和CIAP有何作用？为何一般采用CIAP而不采用BAP？10.依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶和T4或T7噬菌体RNA聚合酶，这类聚合酶可用于表达外源基因，阐述常用的构建策略？①将T7 RNA 聚合酶基因置于 E.coli lacUV5 启动子之下，插入到λ噬菌体中，感染E.coli ，建立稳定的溶源菌。