-生物素-酶联接在一起，起到了生物反应放大
效应，大大的提高了ELISA的敏感度。此方法
常用于检测微量抗原或抗体。
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生物素标 亲和素 记的酶 生物素标 记的抗体
A B C | E L I S A
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（二）酶联免疫电转移印斑法
免疫印迹法(Western blotting) 免疫印迹法可对非放射性标记蛋白组成的复 杂混合物中的某些特定蛋白进行鉴别和定量，该 法将凝胶电泳与固相免疫结合，把电泳分区的蛋 白质转移至固相载体，再用酶免疫、放射免疫和 化学发光等技术测定。 免疫印迹法与 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结合， 广泛应用于临床和基础研究中检测基因产物的多 态性抗原表达，艾滋病血清中抗体或抗原的表达 及风湿性疾病中类风湿性因子和抗体等。 32
OD405 OD280
= 0.3-0.7
0.5左右即1分子I gG结合 上1-2个酶蛋白
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二、最适工作浓度的选择 在建立某一ELISA检测中，应对包被抗原 或抗体的浓度和酶标抗体或抗原的浓度予以选 择，以达到最合适工作的测定条件和测定费用 的节省。 （一）直接法测酶标抗体 （二）间接法测抗体 （三）夹心法测抗原
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96 孔 酶 标 板
A B C D E F G H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
可拆卸酶标条
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（一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。
1. 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗 体，然后洗涤。
2. 加受检标本使之与固相抗体接触反应一段时 间，形成固相抗原抗体复合物，然后洗涤。 3. 加酶标抗体，然后洗涤。 4. 加底物显色，根据颜色的深浅程度对该抗原 定性或定量。
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第三节 固相酶免疫测定的原理和类型
一、基本原理 酶联免疫吸附测定（ ELISA ）方法的基 本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相 载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或 抗体与某种酶联接成酶标抗原或抗体，这种
酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留
酶的活性。
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在酶标检测中，按不同的步骤把受检标
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间 接 法
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（三）竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测 定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶 标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于 固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比 。
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操作步骤： • 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗 体，然后洗涤。 • 待测管中加受检标本与一定量酶标抗原的混 合溶液，与固相抗体反应，然后洗涤。在参 考管中只加酶标抗原。 • 加底物显色，参考管中由于结合的酶标抗原 量最多，颜色最深。参考管颜色深度与待测 管颜色之差，代表受检标本中抗原的量。待 测管越淡，表示标本中抗原量越多。
因子或分泌特异性抗体，加入酶标抗体后即 可通过与底物呈显色反应，根据显色的深浅 测定出抗体量，也可在显微镜下观察抗体形 成细胞或用酶联免疫斑点仪进行分析。
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B
B
E L I S P O T
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谢 谢
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6
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（二）抗原和抗体 在ELISA实验中要求所用的抗原纯度高、 抗体效价高，结合力强。 （三）免疫吸附剂 固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将 抗原或抗体固化的过程称为包被。在包被后再 用 1~5% 牛血清白蛋白包被一次，可以消除非 特异性吸附干扰，这一过程称为封闭。
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（四）酶和底物 ELISA中所用的酶要求纯度高，催化反应的转 化率高，专一性强，制备成的酶标抗体或抗原性质 稳定，继续保留着它的活性部分和催化底物的力。 最常用的酶为辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
酶免疫测定具有高度的特异性和敏感性， 几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测 。它的最小测量达ng甚至pg水平。
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（一）ABC- ELISA 亲和素 - 生物素系统在 ELISA 检测中被广 泛应用。一个分子的亲和素能与 4个分子的生 物素结合，用生物素分别接上抗体和酶，通
过亲和素的桥梁作用，将抗体-生物素-亲和素
本和酶标抗原或酶标抗体与固相载体表面的
抗原或抗体反应。用洗涤的方法使固相载体 上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开， 加入酶反应的底物后，底物被催化变为有色 产物，根据颜色反应的深浅进行定性或定量
分析。
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二、方法类型和操作步骤 固相酶免疫测定可用于测定抗原，也可用 于测定抗体，可以定量，也可以定性。 三个必要的试剂： ①固相抗原或抗体 ②酶标记的抗体或抗原 ③酶反应的底物 主要器材：
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第一节
酶免疫技术的分类
酶免疫技术 ──是以酶标记的抗体或抗原作为 主要试剂的免疫检测方法，是标记免疫技术中最 常用的一种检测方法。 酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶 免疫测定两大类。酶免疫组织化学技术应用酶标 记的抗体与组织切片上相应抗原起反应，然后与 酶底物作用，形成有色沉淀物，可以在普通光学 显微镜下观察。如酶作用的产物电子密度发生一 定的改变，则可用电子显微镜观察，称为酶免疫 电镜技术。
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酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否要分离 结合的与游离的酶标记物而分为均相和非均相两 种类型。 Ab*+Ag → Ab*Ag +Ab* Ab*Ag 为结合的标记物， Ab* 为游离的酶标 记物。在抗原抗体反应后，把 Ab*Ag 与 Ab* 分离 ，然后测定 Ab*Ag 或 Ab* 中的标记物的量，从而 推算出标本中的Ag量，这种方法称为非均相法。
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2.过碘酸盐氧化法
本法只用辣根过氧化物 酶的交联。用过碘酸盐将其 分子表面的多糖氧化为醛基。 用硼氢化钠中和多余的过碘 酸。使酶上的醛基与蛋白质 （抗体）结合。 E-OH + NaIO4
E-CHO + NH2-IgG E-CH=N-IgG + NaHB4 E-CH2NH-IgG
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标记率：
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双 抗 夹 心 法 示 意 图
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（二）间接法 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为 利用酶标记的抗抗体检测已与固相抗原结合的受 检抗体。 1. 将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原， 然后洗涤。 2. 加稀释的受检血清，形成固相抗原抗体复合物， 然后洗涤。 3. 加酶标抗体（酶标抗抗体），然后洗涤。 4. 加底物显色，颜色的深浅程度表示受检抗体量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种 酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
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免疫标记技术优势?
由于免疫标记技术有较高的敏感性，很多过去 传统血清学方法测不出的情况都有可用这些方法进 行；由于能定位，因此对一些疾病的发病机制提供 了有力的证据，如可在细胞和亚细胞水平上观察和 鉴定抗原（或受体），抗体或抗原抗体复合物。 免疫标记技术优点：特异性强、敏感度高、检 测速度快、能定性和定量甚至定位、且易于观察。 荧光抗体技术、放射免疫测定法和酶免疫测定 法，通常被称为三大标记技术。
E-NH2 + HC-(CH3)-CH O
E-N=CH-(CH3)-CH + NH2-P
E-N=CH(CH2)3CH=N-P
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一步法 优点：操作简单、重复性好。
缺点：标记效率低（6%），酶与酶、抗体 与抗体间也有交联。
二步法 优点：标记效率高，是一步法2-8倍，无酶 与酶、抗体与抗体间的交联。 缺点：操作较复杂，抗体与酶易变性，透 析时抗体易沉淀析出。
不需进行 Ab*Ag 与 Ab* 分离，可以直接测定 游离的Ab*量，从而推算出标本中的 Ag量，这种 方法称为均相法。
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酶免疫技术分类
酶免疫技术
酶免疫测定 酶免疫组织化学技术
非均相酶免疫测定
均相酶免疫测定
固相酶免疫测定
液相酶免疫测定
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第二节
固相酶免疫测定的技术要点
固相酶联免疫测定的技术要点包括三个方面： 即试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。 一、试剂的制备 ELISA的主要试剂为特异性的抗原或抗体、酶 标记的抗原或抗体和与标记酶关联的酶反应底物。 （一）固相载体 ELISA最常用的载体是聚苯乙烯，它具有较强 的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其后 保留原来的免疫活性。
第七章
免疫标记技术?
酶免疫标记技术
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免疫标记技术包括两个方面，一是标记物 与抗原、抗体的连接技术；二是标记后的抗原、 抗体进行特异性检测的方法。
免疫标记技术是指用放射性同位素、荧光 素、酶、胶体金、化学（或生物）发光剂等标 记物，标记抗原或抗体进行的抗原抗体反应； 并借助于荧光显微镜、同位素液闪仪、酶标仪 、化学发光仪等精密仪器测定抗原抗体复合物 中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步 1 提高了免疫检测技术的敏感性。
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三、测定方法的标准化
（一）加样 要保证每次加样的精确性。
（二）保温 要严格控制保温时间和温度。
（三）洗涤 在ELISA实验中，洗涤虽不是一反应
步骤，但却决定着实验成败的关键。洗涤
的目的是洗去反应液中没有与固相的抗原
或抗体结合的物质以及在反应过程中非特
异性吸于固相载体的干扰物质。 （四）比色 用酶标仪读数
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在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺。
（五）结合物
用化学的方法将抗原或抗体同酶结合，制成酶 标记的抗原或抗体称为酶结合物，用于酶免疫检测 试验。最常用的标记方法主要有两种，即戌二醛交 联标记法和过碘酸盐氧化标记法。 8
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1.戌二醛交联法 戌二醛是一种常用的同型双功能交联剂，它 的两个醛基可分别与酶蛋白(E)和抗体或抗原的蛋 白(P)氨基形成Schiff碱(-N=C-)形成桥连接起来。 戌二醛交联法分为一步法和二步法。