蜂蜜中甜味剂、防腐剂的检测
北京莱伯泰科仪器有限公司
摘要：本文建立了萃取法-HPLC检测法同时测定蜂蜜样品中安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸正丁酯等8种甜味剂和防腐剂的分析方法，采用紫外检测器，检测波长为254nm。
萃取方法简单，HPLC检测结果准确，具有良好的标准曲线线性、重复性以及检测结果，该法可在25min内完成样品中8种物质的全部检测。
前言：
“民以食为天”，食品安全日益受到民众的关注。
国家在《食品添加剂使用卫生标准》中严格规定了食品中各添加剂的添加种类和添加量，但却不乏有不法分子为了功力违法添加非法添加剂或超标添加的事件发生。
甜味剂是赋予食品或饲料以甜味的食物添加剂，安赛蜜和糖精钠为最为常用的添加剂。
防腐剂为抑制微生物生长繁殖，防止食品腐败变质的添加剂，苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类防腐剂在食品中最为常用。
不法分子为了谋取暴利或延长食品保质时间，故意超量添加，在食品标识中无明确说明，对人体产生一定影响。
为防患食品安全问题，要求仪器行业提高仪器检测能力，快速寻找各种检测方法，本文通过萃取-HPLC在25min内同时检测蜂蜜中8种甜味剂和防腐剂，各物质达到完全分离，检测快速准确，确为食品添加的检测手段提供一种快速方法。
1、实验部分：
1.1仪器与试剂
LC600二元高压梯度高效液相色谱系统（北京莱伯泰科仪器有限公司，北京）
标样：
安赛蜜（1mg/mL，中国计量科学研究院）
糖精钠（1mg/mL，中国计量科学研究院）
苯甲酸（1mg/mL，中国计量科学研究院）
山梨酸（1mg/mL，中国计量科学研究院）
对羟基苯甲酸甲酯（≥99.0%，北京化学试剂公司）
对羟基苯甲酸乙酯（≥99.0%，国药集团化学试剂有限公司）
对羟基苯甲酸丙酯（≥99.0%，北京化学试剂公司）
对羟基苯甲酸正丁酯（≥99.0%，国药集团化学试剂有限公司）
试剂：
甲醇（色谱纯，Fischer公司）
无水乙醇：优级醇，99%
乙酸铵缓冲液：0.02mol/L
盐酸溶液：0.03mol/L
1.2标样和样品处理
1.2.1标准溶液配制
分别准确称取0.1g对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸正丁酯（精确到0.001g），
甲醇稀释至浓度为1mg/mL作为标准储备液。
准确、等量量取安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸正丁酯标准储备液，用甲醇稀释配成100μg/mL的混合标准溶液，用甲醇：水溶液（5:5）逐级稀释混合标准溶液，制备浓度依次为0.1μg/mL、
0.5μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的标准溶液，液相色谱进样备用。
1.2.2样品提取
称取试样约2.5g（精确至0.01g）于50mL烧杯中，依次加入2mL水，1mL盐酸溶液，混匀，再加入20mL无水乙醇，用超声波清洗器提取10min；取出，用无水乙醇定容于50mL容量瓶至刻度，摇匀。
取1mL溶液于离心管中，加入1mL去离子水，混匀，用0.45μm的滤膜过滤，供液相色谱仪测定。
同法制备平行样品三份。
1.3检测仪器的检测条件
1.3.1色谱条件
高效液相色谱
色谱柱：LabTech C18（4.6mm X250 mm，5μm）
检测波长：254nm
柱温：40℃
流动相：流动相A：甲醇，流动相B：乙酸铵缓冲溶液（0.02mol/L）
梯度系统：
流速：1mL/min
进样量：20 uL
2、结果与讨论
2.1 8种甜味剂和防腐剂出峰顺序判断及色谱图
将安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸正丁酯单质与8种标准品的混合溶液分别进入色谱检测，根据出峰时间判断8种标准品的出峰顺序为：安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸正丁酯。
色谱图及出峰时间见下图及下表。
酯
图1. 8种甜味剂和防腐剂色谱图
─────────────────────────────────────────────────────── 序号 保留时间 名称 浓度 峰面积 峰分离度 理论塔板数 有效塔板数 峰拖尾因子 ─────────────────────────────────────────────────────── 1 3.942 安赛蜜 10 180714 4.33 3991 0 1.72 2 5.125 糖精钠 10 65785 1.60 5044 269 1.47 3 5.598 苯甲酸 10 75536 4.28 5808 508 1.36 4 7.068 山梨酸 10 2721991 29.90 5454 1067 1.17 5 15.338 对羟基苯甲酸甲酯 10 1080684 7.51 143707 79336 1.57 6 16.728 对羟基苯甲酸乙酯 10 1187600 8.94 109218 63811 1.51 7 18.958 对羟基苯甲酸丙酯 10 1111217 10.00 68870 43209 1.43 8 22.445 对羟基苯甲酸正丁酯 10 1020555 0.00 51019 34673 1.29 ─────────────────────────────────────────────────────── 总计 80 7444082
2.2 重复性计算
将浓度为100μg/mL 的混合标准溶液重复进样5次，计算出峰时间重复性，见表2，图2为5次进样重叠色谱图。
表2 出峰时间重复性计算
图2 8种甜味剂和防腐剂重叠色谱图
2.3 标准曲线
依次将浓度为0.1μg/mL 、0.5μg/mL 、1μg/mL 、10μg/mL 、50μg/mL 、100μg/mL 的标准溶液注入高效液相色谱系统中进行检测，根据样品浓度和峰面积计算甜味剂、防腐剂各标准品的标准曲线及线性系数。
其中线性系数分别为安赛蜜R 2
=0.999907，糖精钠R 2
=0.999981，苯甲酸R 2
=0.999992，山梨酸R 2
=0.9999977，对羟基苯甲酸甲酯R 2
=0.999999，对羟基苯甲酸乙酯R 2
=0.999997，对羟基苯甲酸丙酯R 2
=0.999980，对羟基苯甲酸正丁酯R 2
=0.999995。
安赛蜜标准曲线 糖精钠标准曲线
苯甲酸标准曲线 山梨酸标准曲线
对羟基苯甲酸甲酯标准曲线
对羟基苯甲酸乙酯标准曲线
对羟基苯甲酸丙酯标准曲线 对羟基苯甲酸正丁酯标准曲线
图3 8种甜蜜素和防腐剂标准曲线
2.4蜂蜜中甜味剂和防腐剂检测结果及含量计算
将1.2.2中蜂蜜的提取液（平行3针）注入高效液相色谱中检测，检测色谱图及检测结果、含量计算请见图4和表3。
───────────────────────────────────────────────────────序号保留时间名称浓度峰面积峰分离度理论塔板数有效塔板数峰拖尾因子
───────────────────────────────────────────────────────
1 4.023 安赛蜜 0 0
2 5.21
3 糖精钠 0 0
3 5.450 苯甲酸 0.587 4417 2.49 1027 0 2.63
4 6.908 山梨酸 0.2584 68826 2.08 3403 152 1.54
5 15.357 对羟基苯甲酸甲酯 0.08548 9012 2.74 138755 5774
6 1.40
6 16.742 对羟基苯甲酸乙酯 0.1076 12431 8.91 118041 53698 1.01
7 18.957 对羟基苯甲酸丙酯 0.2011 20887 10.27 66213 33614 1.00
8 22.417 对羟基苯甲酸正丁酯 0.2267 22862 1.70 59169 33896 1.14
───────────────────────────────────────────────────────总计 1.466 138435
表3 蜂蜜中（三份平行样品）甜味剂和防腐剂含量计算
结论：蜂蜜中不含有甜味剂安赛蜜和糖精钠，含有苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸正丁酯6种防腐剂，含量请见表3。
3、结论：
本文建立了萃取法-HPLC检测法同时测定蜂蜜样品中8种甜味剂和防腐剂的分析方法。
该法25min内使8种物质达到基线分离；重复性高，各物质RSD分别为安赛蜜0.213%，糖精钠0.385%，苯甲酸0.316%，山梨酸0.444%，对羟基苯甲酸甲酯0.064%，对羟基苯甲酸乙酯0.038%，对羟基苯甲酸丙酯0.078%，对羟基苯甲酸正丁酯0.155%。
实验结果表明，蜂蜜样品中不含安赛蜜、糖精钠甜味剂，含有苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类防腐剂。
蜂蜜样品处理方法简单，HPLC检测快速、准确，采用萃取-HPLC法可快速检测食品中多种甜味剂和防腐剂。
撰稿人：赵玲玲。