长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、X S区编码外膜蛋白（HBsAg） C区编码HBeAg 、HBcAg p区编码DNA聚合酶 X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表 达有关。
短链S为正链：长短精不品课一件
pre-s2 S
pre-s1
P
HBV DNA 3.2 kb C
pre-c X
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HBV基因组结构
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扩增位置
引物序列
扩
增片段大小
NS基因
▪ 5’-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3’
▪ 5’-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3’
190 (bp)
NS基因
▪ 5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’ ▪ 5’-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3’
241 (bp)
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（三）临床意义
▪ 流感病毒的诊断过去主要靠鸡胚羊膜腔 培养和血清学血凝抑制试验，这些方法比较 费时，灵敏度低，难以作出早期诊断。
▪
PCR法敏感、特异、简便、快速，并且
可用于流感病毒的分型和流行病学调查。
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三. 人类免疫缺陷病毒（HIV)
▪ HIV，human immunodeficiency virus ▪ AIDS，acquired immunodeficiency syndrome ▪ HIV为艾滋病的病原体。现已发现引起艾滋病
▪ 原理:
检测 体系
① 捕获探针 ② 靶探针1 ③ 靶探针2 ④ bDNA分子:DNA主链上结
合多个侧链
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▪ 捕获探针固化在微孔板上 靶探针1分别与捕获探针及待测核酸杂交 靶探针2分别与待测核酸及bDNA杂交 形成复合物：
固相支 持物
捕获 探针
靶探 针1 CEs
待测 核酸
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靶探 针2 LEs
There are 16 dFra bibliotekfferent H antigens (H1 to H16) and nine different N antigens 精(N品1课t件o N9).
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（一）流感病毒基因组结构
▪ 单链RNA病毒，RNA为负链； ▪ 有8个RNA片段或7个RNA片段； ▪ 所有RNA片段5’末端和3’末端高度保守； ▪ 两种不同亚型病毒感染宿主时，会生成基因
2. 阳性结果 假阳性可能性 方法的特异性 受到污染
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3. 定性检测结果 有时不能提供病原体活力 相关信息 临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者 样本中仍可以检测出相应的病原体。 有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。
4. 疾病状况的判断 检测出病原体的存在并 不能说此病原体就是引起疾病的直接原因。 该病原体可能是一种正常菌群
C基因 5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’
258
5’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’
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有时为了证实扩增产物的特异性，对扩增 产物进行以下分析：
▪
RLFP
▪
斑点杂交
▪
Southern杂交
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2. 支链DNA信号放大技术(bDNA）
第三篇 应用篇
▪ 分子诊断以DNA、RNA和蛋白质为材料，通 过应用分子生物学技术，检查基因的存在、 结构缺陷或表达异常，从而对人体状态和 疾病作出诊断。
▪ 着重介绍感染性疾病、遗传性疾病、复杂 疾病等的分子诊断基本策略和方法。
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分子诊断的临床意义在于不仅能够 对疾病作出早期诊断、确切诊断，而且还 能确定个体归于疾病的易感性以及疾病的 分期分型、疗效监测、预后判断等。随着 分子诊断学的发展，分子诊断的原理和方 法不仅适用于遗传性疾病，而且也广泛应 用于感染性疾病、肿瘤等医学领域。
正常为乙型肝炎临床治愈指标；
3.判断病情，指导制定合理的治疗方案
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4.病毒耐药性的检测 ▪ 乙肝病毒DNA聚合酶YMDD处的突变是病毒
产生耐药性的重要原因，通过监测YMDD的突 变情况，可以获得病毒耐药性方面的信息， 指导抗病毒治疗。
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二、 流行性感冒病毒
▪ 流行性感冒病毒(Influenza virus)，是引 起流行性感冒的病原体;
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2. 完整检出策略和方法
按照诊断→分型→亚型→耐 药性检测的思路，利用多种分子诊断手 段对感染性病原体进行分析。
基因芯片、基因测序等
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二、感染性疾病分子诊断的常用方法
根据目的基因是否被放大， 可分为杂交法和 扩增法。 ▪ 信号放大技术检测方法
靶分子数目不变，而检测的探针信号放大 采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加探 针标志物的浓度使检测信号得到放大。 ▪ 靶分子扩增技术检测方法 靶分子（RNA、DNA或探针）的扩增 ▪ PCR、替代扩增、LCR等
靶RNA 3’端
5'
序列互补;引
物B的碱基序
5'
列与cDNA 3’ 3'
端序列互补
T7RNA聚合酶
5'
3'
5' 靶RNA
RT RNAseH
3' cDNA 5' RNA
3' cDNA
RT
引物B
3' cDNA模板
5'
引物A 5'
3'
5'
100-1000 RNA扩增子
3'
5'
3'RNA
5' 3'
引物B
RNAseH
一般性检出策略，即只需要提供是否有 某种病原体的感染；
完整检出策略，即不仅对病原体做出诊 断，还要进行分型（包括亚型）和耐 药性方面的检测。
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1. 一般性检出策略和方法
针对特异性的核酸序列进行核酸分子 探针杂交，或者利用常规PCR技术直接 检出微生物的DNA/RNA，它能够判断有 无感染和是何种病原体感染。
ELISA Western-blot 组织化学染色
蛋白质芯片
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第十四章 感染性疾病的分子诊断
生物化学与分子生物学学科 2011.4
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第一节 概 述
感染性疾病：由某种病原体所致，通过不 同方式引起人体发生感染并出现临床症 状的疾病。
病原体：病毒、细菌、原虫、支原体、 衣原体、立克次体。
bDNA复 合物
分支链DNA信号放大技术(bDNA)
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▪ 信号检测：bDNA可结合很多酶标探针，酶催 化底物（1,2-二恶二酮，dioxetane）发光， 使核酸信号放大，且发光强度与DNA量成正比。
▪ 优点：放大倍数确定 阳性检出率高 稳定性和可重复性好 操作简便，省时，易于普及
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3.基因芯片技术
标本经PCR扩增后与芯片上的特异探 针进行杂交，可以检测：
是否有病毒感染 感染病毒的种类及亚型 病毒的耐药情况 特点：可同时进行大量标本的检测
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HBV耐药突变
lamivudine adefovir entecavir telbivudine
近年来陆续上市的核苷(酸)类似物对HBV的治疗压力集中在P区。 干扰素治疗对HBV的压力主要集中在前C/C区及前S区。
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（三）临床意义
1.早期诊断
免疫学检测敏感性： 0.1µg/ml
核酸杂交检测敏感性：0.1pg/ml
PCR检测：
0.1fg/ml
因此，在感染早期即可通过DNA检测证实 病毒的存在。
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2.监测治疗效果: ▪ HBVDNA>107拷贝/ml提示病毒复制活跃； ▪ HBVDNA＜104拷贝/ml治疗有一定疗效； ▪ HBVDNA＜103拷贝/ml、HBeAg阴转、转氨酶
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五、感染性疾病分子诊断的临床应用 及评价
▪ 用于感染性疾病治疗的监控和预测、病情 发展过程的危险性评价及疾病预后等。
▪ 耐用性的检测 ▪ 细菌的分型 ▪ 流行病调查
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第二节 病毒的基因检测
人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝 炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾 病的75%左右。400多种不同病毒。
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常规检测方法：
▪
免疫学方法
▪
微生物学方法
受敏感性、特异性限制，不易早期诊断， 并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信 息。
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分子生物学方法：
▪
聚合酶链式反应（PCR）
▪
核酸杂交
▪
基因芯片
早期、特异地进行诊断，能提供 病原体分型及耐药性方面的信息，同时进行 大量基因的检测。
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一、感染性疾病的分子诊断，其诊断 策略可以分为以下两种：
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扩增位置
引物序列
扩增片断（bp)
P、X基因
5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’
278
5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’
C基因 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’
477
5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’
病毒结构：大 小：20-300nm 核心区：核酸（DNA或RNA） 外周衣壳：蛋白质 包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）
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一、 乙型肝炎病毒
我 国 是 HBV 高 流 行 区 ， 50% － 70% 的 人 受 过感染，8%－10%是HBV携带者，肝炎患者 中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬变，HBV 又与原发性肝癌密切相关。 外壳（HBsAg): 外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)： DNA