4.病毒耐药性的检测 • 乙肝病毒DNA聚合酶YMDD处的突变是 病毒产生耐药性的重要原因，通过监测 YMDD的突变情况，可以获得病毒耐药性方 面的信息，指导抗病毒治疗。
二、
流行性感冒病毒
• 流行性感冒病毒(Influenza virus)，是引起流行性
感冒的病原体; • 分为甲(A)、乙(B)和丙(C)3个型别; • 根据病毒颗粒表面血凝素(Haemagglutinin ，HA) 和神经氨酸酶(Neuramiridase，NA)的抗原性，甲 型流感病毒又可分为不同的亚型。 • 甲型流感病毒易发生变异，致病力强，1918年发生 在西方国家的大流感杀死了几千万人， 即是由甲型 流感病毒引起。
病毒结构：大 小：20-300nm
核心区：核酸（DNA或RNA） 外周衣壳：蛋白质 包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）
一、 乙型肝炎病毒
我国是 HBV 高流行区， 50% － 70% 的人受 过感染， 8% － 10% 是 HBV 携带者，肝炎患者 中 60% 是慢性肝炎患者，导致肝硬变， HBV
又与原发性肝癌密切相关。
5'
5' 3' 5' 3'
引物A 5' 靶RNA RT RNAseH 3' RT 引物B 3' 5' cDNA cDNA模板 3' cDNA 5' RNA
5' 5' 3'
T7RNA聚合酶 3'
5' 3' 3'
引物A
5'
5' cDNA RNAseH 3' RNA 5' cDNA
100-1000 RNA扩增子 5' 3'RNA
外壳（HBsAg): 外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)： DNA DNA 聚合酶 HBcAg
Dane颗粒（完整的病毒）形态
HBsAg
（外膜蛋白）
HBcAg
（核衣壳蛋白）
HBV DNA
DNAPol
完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米 由双层外壳和一个核心组成的，核心直径为27纳米， 内含DNA双链和DNA多聚酶
寄生虫
。
常规检测方法： • 免疫学方法 • 微生物学方法 受敏感性、特异性限制，不易早期诊断， 并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信 息。
感染性疾病的分子诊断策略
• 一般性策略（检出病原体）：
– 判断有无感染 – 是何种病原体感染 – 常用方法：PCR ＋ 杂交
• 完整性策略：
– 检出病原体 – 分型（分类）－亚型－耐药性 – 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序
根据目的基因是否被放大， 可分为杂交法和扩增法。 • 信号放大技术检测方法 靶分子数目不变，而检测的探针信号放大 采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加探针标志 物的浓度使检测信号得到放大。 • 靶分子扩增技术检测方法 靶分子（RNA、DNA或探针）的扩增 • PCR、替代扩增、LCR等
引物A 5’端带 有T7RNA聚合 酶结合位点， 3’端碱基与靶 RNA 3’端序列 互补;引物B 的碱基序列与 cDNA 3’端序 列互补
5'
5' 3' 5' 3'
引物A 5' 靶RNA RT RNAseH 3' RT 引物B 3' 5' cDNA cDNA模板 3' cDNA 5' RNA
5' 5' 3'
T7RNA聚合酶 3'
5' 3' 3'
引物A
5'
5' cDNA RNAseH 3' RNA 5' cDNA
100-1000 RNA扩增子 5' 3'RNA
There are 16 different H antigens (H1 to H16) and nine different N antigens (N1 to N9).
（一）流感病毒基因组结构
• 单链RNA病毒，RNA为负链； • 有8个RNA片段或7个RNA片段； • 所有RNA片段5’末端和3’末端高度保守；
HBV基因组结构
S
P
pre-S1
pre-S1蛋白
pre-S2
HBV DNA 3.2 kb C
pre-S2蛋白
HBsAg HBeAg HBcAg DNAP
S pre-C C
pre-c
X
P
X
HBxAg
HBV 基因分型
• HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因 型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基 因型： – A型主要存在于白人， – B型和C型主要存在于亚洲人群 – E型主要存在于西非 – F型仅见于中南美洲的土著人 – G型和H型很少见 • 不同基因型序列长度不同，主要是前S1区的不同。我国流 行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南 以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南 尤其是西北有较高比例的D型
固相支 持物
捕获 探针
靶探 针1 CEs
待测 核酸
靶探 针2 LEs
bDNA 复合物
分支链DNA信号放大技术(bDNA)
• 信号检测：bDNA可结合很多酶标探针， 酶催化底物（1,2-二恶二酮，dioxetane） 发光，使核酸信号放大，且发光强度与 DNA量成正比。 • 优点：放大倍数确定 阳性检出率高 稳定性和可重复性好 操作简便，省时，易于普及
杂交PCR，可提供直接、准确的病原学诊断证
据。引物是根据S、C、P、X基因中高度保守
序列设计，决定扩增的特异性和敏感度。
扩增位置
P、X基因
引物序列
5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’ 5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’
扩增片断（bp)
278
C基因
5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’ 5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’ 5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’ 5’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’
第八、九章 感染性疾病的分子诊断
感染的慨念
感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原微生物：致病菌（条件致病菌）

共 生 状 态
人
微 生 物
人
体 微 生 物
体
不 同 的 感 染 状 态
在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生
感染性疾病：由某种病原体所致，
通过不同方式引起人体发生感染并
出现临床症状的疾病。 病原体：病毒、细菌、原虫、支原 体、衣原体、立克次体、螺旋体、
五、感染性疾病分子诊断 的临床应用及评价
• 用于感染性疾病治疗的监控和预测、病 情发展过程的危险性评价及疾病预后等。 • 耐药性的检测 • 细菌的分型 • 流行病调查
第一节 病毒的基因检测
人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝
炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾
病的75%左右。400多种不同病毒。
• 两种不同亚型病毒感染宿主时，会生成基因 重配的新病毒； • RNA基因在复制过程中 常会发生点突变。 •
（二）分子诊断方法 • 可采用RT-PCR、FQ-PCR检测流感病毒 RNA。引物常按流感病毒保守的非结构基因 （NS）的序列进行设计。 • 为证实PCR扩增产物的特异性或提高检测的 灵敏度，可用限制性内切酶分析法、斑点杂 交法、Southern印迹法进行扩增产物的分析。
HBV耐药检测（ YMDD突变检测方法）
YMDD突变检测方法 • 1. 基因测序法 • 2. 荧光定量PCR方法
– 基本原理 • 确定探针特定的TM值来区分是否突变 – 常用方法 • 覆盖突变位点荧光双探针杂交
YIDD
46.91℃
YMDD
54.64℃
YVDD
50.74℃
（三）临床意义
1.早期诊断
5' 3'
引物B
图8-3
NASBA原理示意图
nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)
• NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器， 不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制， 循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR， 特异性好。
三、感染性疾病分子诊断 的标本处理
扩增位置 引物序列 片段大小 NS基因 • 5’-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3’
477
C基因
258
有时为了证实扩增产物的特异性，对扩增产 物进行以下分析： • RLFP • 斑点杂交 • Southern杂交
2. 支链DNA信号放大技术(bDNA）
• 原理:
① 捕获探针
检测
体系
② 靶探针1
③ 靶探针2
④ bDNA分子:DNA主链上结
合多个侧链
• 捕获探针固化在微孔板上 靶探针1分别与捕获探针及待测核酸杂交 靶探针2分别与待测核酸及bDNA杂交 形成复合物：
感染性疾病分子诊断标志物
• • • • 病原体核酸分子（DNA/RNA） 基因表达产物 代谢物 免疫应答分子 细 胞 免 疫 体 液 免 疫 T T
致敏T细胞 淋巴因子
B
浆细胞
IgM 感染早期出现 IgG 临近恢复期出现 IgA IgD IgE 与原虫和蠕虫感染有关
二、感染性疾病分子诊断 的常用方法
5' 3'
引物B
图8-3
NASBA原理示意图
nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)