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实验七 微生物的分离、培养和菌种保藏


实验程序14
(微生物的接种方法—液体接种和穿刺接种)


液体接种法:包括从斜面菌种接入培养液,或从液体菌 种接入液体培养液,两种情况都可以用接种环接种。但 在培养量比较大的情况下,液体接种宜采用移液管接种, 同时要求无菌操作。 穿刺接种法:用接种针经火焰灭菌后,沾取少量菌种, 垂直地穿入试管固体培养基中心至底部,然后沿着原接 种线将针拔出,要做到手稳、动作轻巧迅速,最后塞上 棉塞。再将接种针上残留的菌体在火焰上烧掉。
实验程序12
(微生物的接种方法—斜面接种法)




左手平托两支试管,拇指按住试管底部。外侧使是菌 种试管,内侧是待接的空白斜面。(两支试管的斜面 同时向上),右手将棉塞旋松,以便在接种时容易拔 出。 右手拿接种环,在火焰上先将环端烧红灭菌,然后将 有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。 将两支试管的上端并齐,靠近火焰,用右手小指和掌 心将两支试管的棉塞一并夹住拔出,棉塞仍夹在手中, 然后让试管口缓缓过火焰。 将已灼烧过的接种环伸入外侧的菌种试管内。先冷却, 而后再用环沾取一定量的菌苔,将沾有菌苔的接种环 抽出试管。
实验程序21
(微生物的菌种保藏方法)


斜面冰箱保藏法:将菌种接在新鲜斜面培养基上,定温培养长 出丰满菌苔后,一般形成芽孢的细菌要形成芽孢,形成孢子的 微生物要长出孢子,贴上标签,放在试管架上,在棉塞部位用 尼龙紙或防水紙包好,放入40C冰箱中保藏。一般每隔3个月至 半年用新鲜培养基移植1次。方法简便,实验室均采用。 缺点:移接代数太多,易产生变异、退化。 石蜡封藏法:在已长好的斜面菌种上加入无菌液体石蜡油,高 出斜面1cm直立试管放入冰箱保藏,适用保存细菌和放线菌。 石蜡的处理:250mL三角瓶装100mL液体石蜡, 1.05kg/cm3高压灭菌30min,然后放在1050C左右的烘箱中 1h,使水分蒸发掉。
实验程序22
(微生物的菌种保藏方法)

砂土管保藏法:(可用于保藏产孢子的放线菌、霉菌和产芽孢的 细菌)。 1.砂土管的制备:取河沙若干,用40目过筛,出去大颗粒,加 10%HCl后煮沸30min,除去有机质(也可用10%HCl浸泡2— 4h)。最后倒去酸水,用自来水冲洗至中性,烘干备用。另取 0.3m以下非耕作层的瘦黄土若干,晒干磨细,过120目筛。 2.按 土:砂=1:4 的比例均匀混合,装入指形管中,以1cm 高为宜,塞上棉塞,160~1700C干热灭菌2h。 3.在新鲜菌种斜面上加入3mL左右的无菌水,用无菌接种环制 成菌悬液,用无菌吸管吸取0.2~0.3mL的菌悬液放入每个砂土 管中,用接种环拌匀,并贴上标签,注明菌名。 4.菌液加好后,立即进行抽真空干燥,要求在24h内抽干,尤其 是夏天要求较短时间内抽干。摇散砂土,放干燥器内冰箱保藏。
实验程序20
(微生物的菌种保藏方法)



菌种保藏是微生物学工作中的重要一环,微生物菌种保藏的 目的要求达到以下三点: 1.保持原种形状,延缓或防止退化。 2.保持活力而不死。 3.保证纯培养,防止污染。 微生物菌种保藏的关键是使微生物代谢作用缓慢,处于休眠 状态。为此,要求降低其体内酶的活性。一般采用低温、干 燥和缺氧条件来实现。 菌种保藏的方法有: 冰箱斜面保藏、石蜡封藏法、砂土管保 藏法、冷冻低温干燥法和液氮保藏法等。
实验程序25
(四大类微生物菌落形态的比较和识别)

表-1
思考题



什么叫无菌操作?分离放线菌和真菌为什么 需要分别加重铬酸钾和链霉素? 平板培养时为什么要把培养皿倒置? 好氧培养和厌氧培养的原理和方法有何异同? 试述菌种斜面冰箱保藏、石蜡封藏和砂土管 保藏等方法的原理。
实验程序2
(微生物的分离—稀释平板法)

制备土壤稀释液:(无菌操作过程见教师示范) 1. 称取土壤5g,放入45mL无菌水的三角瓶中,振荡 10min,即为稀释10-1的土壤悬液。 2. 另取装有9mL无菌水试管5支,用记号笔编上10-2、10 -3、10-4、10-5、10-6。取已稀释成10-1的土壤液,振 荡后静止0.5min,用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-2 的无菌水的试管中,并在试管内轻轻吹吸数次,使之充分混 匀,即成10-2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4 10-5 10-6土壤稀释液。 在土壤稀释过程中,应用一支吸管由浓到稀,稀释到底,稀 释方法见图-1。
实验程序
Biblioteka 微生物的分离 微生物的接种方法(示范) 微生物培养中的氧气条件 微生物的菌种保藏方法 四大类微生物菌落形态的比较和识别
实验程序1
(微生物的分离)



用稀释平板法(又名混菌法)从土壤中分离真 菌。 用平板涂抹法分离土壤中的放线菌(土壤稀释 液制备同上)。 用平板划线法分离土壤中的细菌(土壤稀释液 的制备同上)。
实验程序5
(微生物的分离—稀释平板法)
实验程序6
(微生物的分离—平板涂抹法)





每组取无菌培养皿2付(每个同学做一只)。在皿底贴上标签, 注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 以无菌操作法先在培养皿中加入0.5%重铬酸钾溶液2滴,取 已熔化的淀粉琼脂培养基2管,分别倒入培养皿,使培养基与 重铬酸钾充分混匀,铺平,制成平板。 凝固后,另取一支吸管吸取10-3或10-4的土壤稀释液 0.2mL放在平板上。 用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒置于28~ 300C条件下培养6~7d,观察放线菌菌落形态及计数菌落, 并计算出每g土壤中放线菌的数量(方法同上)。 挑取单个菌落,接种于相应的斜面培养基上,如果不纯,再 移植纯化,至最后得到纯培养为止。
实验程序13
(微生物的接种方法—斜面接种法)




迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管的底部, 轻轻向上划线(直线或曲线)。 接好种的斜面试管口再次过火焰,棉塞底部过火焰后立即 塞入试管内。 将沾有菌苔的接种环在火焰上烧红灭菌。先在内焰中烧灼, 使其干燥后,再在外焰中烧红,以免菌苔骤热,使菌体爆 溅,造成污染。 放下环后,再将棉塞旋紧,在试管斜面上距试管口2~ 3cm处贴上标签。 28~370C恒温培养。
实 验 七
微生物的分离、培养和菌种保藏
微生物的分离、培养和菌种保藏



目的要求 实验材料 试验程序 思考题
目的要求


初步掌握微生物的分离、培养和菌种保藏 的基本方法。 练习微生物接种、移植和培养的基本技术, 掌握无菌操作技术。
实验材料



样品:新鲜土壤。 培养基:灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养 基、马铃薯蔗糖培养基(10mL装)。 无菌水:带有玻璃珠装有45mL无菌水三角瓶、装有9mL 无菌水的试管。 其它:无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、台天平、 记号笔、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、胶水、水浴锅。 试剂:5000U/mL链霉素液 0.5%重铬酸钾液
实验程序3
(微生物的分离—稀释平板法)
图-1
土壤稀释液的制备和稀释液的取样
实验程序4
(微生物的分离—稀释平板法)


涂平板:每组取培养皿2付,即每个同学做一只。 1.先在无菌培养皿底部贴上标签,注明分离菌名、稀释度、组别、 班级。 2.另取一吸管,以无菌操作法吸取10-4或10-5土壤稀释液1mL, 加在无菌培养皿的一边,在皿的另一边加入2滴5000U/mL的链 霉素液。此时两液严防相混。 3.取已熔化的在水浴锅中保温500C左右的马铃薯蔗糖培养基2管, 分别倒入上述培养皿中(见图-2),轻轻转动培养皿,使菌液、 链霉素液、培养基充分混匀铺平,放在平坦的桌面上,凝固后, 倒置于28~300C恒温培养5~6d。观察真菌菌落形态以及计数 菌落。并计算出每g土壤中真菌的数量。即用某一培养皿内真菌 的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。 挑取单个菌落,接种到斜面培养基上作纯化和性能测定,若不纯, 需要继续分离。
实验程序9
(微生物的分离—平板划线法)
实验程序10
(微生物的接种方法)


接种方法:常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、 试管深层固体培养基的穿刺接种法。 接种工具:常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接 种铲或接种锄、玻璃涂棒等(见图-6)。
图-6
试验程序11
(微生物的接种方法—斜面接种法)
实验程序17
(微生物培养中的氧气条件-厌氧培养)

美兰氧化还原指示剂: 0.006N NaOH 0.015% 美兰溶液 6% 葡萄糖溶液 上列三种溶液在使用时 等量混合,加热使美兰 退色,迅速放入厌氧罐 中。
实验程序18
(微生物培养中的氧气条件-厌氧培养)
实验程序19
(微生物培养中的氧气条件-厌氧培养)
实验程序24
(四大类微生物菌落形态的比较和识别)


区分和识别各大类微生物通常包括菌落形态(群体 形态)和细胞形态(个体形态)两方面的观察。 菌落形态: 菌落表面湿润:细菌——薄而小,酵母菌——厚而 大。 菌落表面干燥:放线菌——密而小,霉菌——松而 大。 细胞形态: 细菌——小而分散 酵母菌——大而分散 放线菌——丝状细 霉菌——丝状粗
实验程序7
(微生物的分离—平板涂抹法)
实验程序8
(微生物的分离—平板划线法)



每组取无菌培养皿2付,在皿底贴上标签,注明事项。取已熔化 的牛肉膏蛋白胨培养基,倒入平皿,制成平板。 凝固后,用接种环取相应的 菌液一环(10-5或10-6)在平板上 划线(教师作示范)。 1.连续划线法:将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续 划线(图-5)。完毕后,倒置于28~300C温室培养。 2.分区划线法:用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环,先在 培养基的一边作第一次平行划线3—4条,再转动培养皿约600C 角,并将接种环上剩余物烧掉,待冷却后通过第一次划线部分作 第二次划线会,同法依次作第三次和第四次划线(见图-5)。 划线完毕,盖上皿盖,倒置于28~300C温室培养。 挑取单个菌落接种于斜面培养基上,如果不纯,再移植纯化,最 后得到纯培养。
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