AGATCT TCTAGA
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA

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5. 细菌在加有Amp+X-Gal的培养基上生长以进行筛选

连接会有三种结果，一是要插入的序列自连；二是切开的质粒重连 ；三是要插入的序列与质粒相连。第一种连接结果没有菌落形成。 第二种连接结果表现为蓝色菌落。只有后一种结果是符合需要的， 产生白色的抗氨苄青霉素菌落。
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灭 菌 器
克隆示意图
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克隆技术流程

分

切
连


转
筛

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分

分离（来自生物组织）、扩增（设计引物，PCR扩增）

mRNA-------DNA------扩增
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引物设计与订购

酶切位点
双酶切、保护碱基、最合适的缓冲液。

引物订购
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保护碱基
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1.用限制性酶消化 DNA 样品
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单酶切
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双酶切
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目的基因的高效分泌表达



概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转运到细胞周质后再 分泌到细胞外 优点：① 防止宿主菌对表达产物的降解；②有利于蛋白质正确折 叠，形成天然构象③减轻宿主细胞代谢负荷④有利于分离 需要在质粒设计时加入一段信号肽基因
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基因克隆操作过程
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克 隆 示 意 图
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加IPTG和X-GAL
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倒平板
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α 互 补
利用α互补原理筛选重组体pUC18
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筛选结果


蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的α LacZ序列编码 的功能性的 α 片段。 白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上α LacZ序列上有 插入片段。
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乳糖和诱导物IPTG的化学结构
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表达型基因工程的载体----以PET32为例
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多克隆位点
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宿主

要考虑宿主菌对密码子的偏爱性 大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中 、弱密码子
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目的产物
目的基因不溶性的高效表达 过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编码的原核多肽或或其 它基因编码的具有其它功能的多肽和结合在一起，这种结合在一起的 形成的不溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。 举例：胰岛素与β-半乳糖苷酶形成包涵体 优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达产物产量。 缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的 适合：不需要翻译后修饰的蛋白质产物
为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆 和体细胞克隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮 助和启发。 多利诞生的过程： 1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。 2.取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一只羊乳腺细胞 基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细 胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。
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DNA聚合酶

Taq酶
用Taq酶扩增DNA时常使片段3‘端凸出一个A。

Pfu酶
产生平末端产物。
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连接酶
T4 DNA Ligase (invitrogen) 16°C过夜或者室温1-2个小时了连接即可。

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基因工程的载体---用于扩增
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克隆载体必备条件
（1）具有复制起点 （2）具有抗菌素抗性基因 （3）具有若干限制酶单一识别位点 （4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。
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外源DNA
载体多克隆 位点
限制性内切酶酶切
5’P 3‘OH 3‘OH 5’P
限制性内切酶酶切
5‘P 3‘OH 3‘OH 5’P
CIAP去除5‘磷酸
5’OH 3’OH 3’OH 5’OH
T4连接酶连接
转化E.Coli
筛选重组子，测序
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重 组 体 筛 选
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重组体
配伍末端的 连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。
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冷循环器
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4.用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
转化细菌有两个基本方法。 一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以促进DNA进入菌体； 二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收。

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用氯化钙化学转化
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用氯化钙化学转化
野生细胞 分离工程 分 离 工 程 酶 野生细胞 基因工程 蛋白质工程 途径工程 工程细胞
酶工程
发酵工程 细胞工程 生物活性物质
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用携带了外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生
质体，发育成具有新性状的完整植株——转基因植物。
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基因工程的工具酶
“手术刀” “缝纫针”
专司切割之职 具有连接之功
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四、分子克隆的技术支撑

核酸凝胶电泳技术 核酸分子连接技术


细菌转化技术
DNA序列分析技术


寡核苷酸合成技术
基因定点突变技术 聚合酶链反应（PCR）技术 DNA序列测定技术
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核酸凝胶电泳
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细菌转化技术 （包括感受态细胞制备）
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聚合酶链反应（PCR）技术
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大规模生产生物活性物质
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选择合适的双酶切缓冲液
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2.用限 制性内 切酶消消化产物
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连接前最好要定量

连接比例摩尔比例为：
插入片度：质粒=10:1---5:1为佳。

质粒几十个ng为佳。
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双酶切
Eco RⅠ切割位点
GAATTC CTTAAG
Bg lⅡ切割位点
3.将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样） ，最后产下多利。
这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。
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目的基因高效表达规律
1. 2.
目的蛋白无须变形和复性就具有生物活性的表达方式 对于翻译后需要修饰蛋白质结构，能够进行目的蛋白结构修饰的 表达方式
3.
能够将目的蛋白分泌到细胞周质、特别是分泌到细胞外的分泌型 表达方式
内切酶 连接酶 聚合酶
“复印机”
行使复制之责
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内切酶
“手术刀” “缝纫针”
专司切割之职 具有连接之功
内切酶 连接酶 聚合酶
“复印机”
行使复制之责
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内切酶
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同裂酶(Isoschizomers）
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同尾酶
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星活性*



所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断 与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后， 不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。 产生Star活性的结果是酶切条带增多。 Differences which can lead to star activity include low ionic strength, high pH, and high (> 5% v/v) glycerol concentrations. High Fidelity (HF) Restriction Enzymes can be used to reduce star activity.
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分子克隆技术
又称为重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在 体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人 们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
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重组DNA操作一般步骤：
（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组 DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞， 并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体 通过培养，获得所需的遗传性状或
有一个“车子”将重组DNA送到宿主细胞中去。
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逆转录酶
使真核基因的制备成为可能。
（1）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。 （ 2 ）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能 在原核表达系统剪接出 mRNA ，没有成熟的 mRNA 就不 能得到相应得产物。 （3）经过逆转录mRNA→cDNA (comple就方便得多。
《基因工程》：张惠展，华东理工大学出版社，2005.

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分子克隆
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基因工程
基因工程是指在微观领域（分子水 平）中，根据分子生物学和遗传学 原理，设计并实施一项把一个生物 体中有用的目的 DNA(遗传信息)转 入另一个生物体中，使后者获得新 的需要的遗传性状或表达所需要的 产物，最终实现该技术的商业价值。
表达出所需要的产物。
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获得需要的目的基因（外源基因）
获得需要的目的基因常用的方法：
（目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，
降低不含目的基因细胞的比例，保持目的基因的稳定性，使目的 基因在宿主细胞内长时间超持和表达