精氨酸激酶（AK）的提取与纯化生物学实验教学中心目录１引言 (1)1.1精氨酸激酶（AK） (1)1.2亲和层析法 (2)1.3电泳法 (2)2.1材料 (2)2.1.1实验材料与试剂 (2)2.1.2仪器设备 (3)2.2方法 (3)2.2.1活化菌种 (3)2.2.2 扩大培养 (4)2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (4)2.2.4 蛋白质提取 (4)2.2.5蛋白质的检测 (4)2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (5)3 结果与分析 (6)3.1蛋白质层析图谱 (6)3.2AK诱导表达电泳图 (7)4总结 (7)参考文献 (8)致谢 (8)精氨酸激酶（AK）的提取与纯化陈蕾（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学0902班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
重组有AK 基因的E. coli Rosetta ，在含有 50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。
当A600 达到 0.6-0.8 时，用终浓度为0.2 mM 的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3 小时。
加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。
通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸化的胍基化合物。
AK在体内催化如下反应：Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。
虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。
按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。
2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK 为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。
3.环节动物Sabellapavonina中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。
1.2亲和层析法亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。
这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。
其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
本实验将采用Ｎｉ离子亲和层析柱进行精氨酸激酶的初步分离与纯化。
1.3电泳法各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。
值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
本实验将用SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
２材料与方法2材料与方法2.1材料2.1.1实验材料与试剂工程菌种：E．coli工程菌株RosstaLB培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，溶于950ml中，用NaOH调节pH至7.0，补加蒸馏水至总体积为1L，分装后高压蒸汽灭菌。
2.1.2仪器设备● YC-1型层析实验冷柜（北京博医康实验仪器司）；● CXG-1型电脑恒温层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司）；● TGL-16LA高速冷冻离心机（星科仪器厂有限公司）；● GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司）；● 超声破壁仪；（上海之信仪器厂有限公司）● 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）● 超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司）● SDS-PAGE电泳仪● 电子天平TE412-L，TE2101-L，CP64（德国Satorins公司）● BS-1E振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂)● SW-CJ-1FD单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）● 3FG-01B电热恒温鼓风干燥箱● 漩涡混合器XH-C（江苏省金坛市医疗仪器厂）● 高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）酒精灯、培养皿、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、离心管、恒温水浴锅等。
2.2方法2.2.1活化菌种取工程菌种100µl接入装有6ml的LB液体培养基的试管（含有6ul卡那青霉素，其工作浓度为50µg/ml）中。
于37℃摇床振荡培养8-12小时。
2.2.2 扩大培养将试管中活化的1ml菌液接种到300mlLB培养基，同时加入300µl卡那青霉素（终浓度50µg/ml）培养基于37℃恒温培养箱中培养2-3小时。
2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当OD=0.6-0.8时,加IPTG150μl至终浓度为0.2mM时AK的表达量达到最大。
2.2.4 蛋白质提取（1）将上述各管于4℃，6000r/m离心10min；（2）弃上清，加入蒸馏水使沉淀物质重悬，再于4℃，6000r/m离心10min；（3）弃上清，使沉淀物质重悬，每1g沉淀加5ml裂解液使其重悬；（4）在冰上进行10min,间隔为2秒钟的超声波破壁, 反复破壁直到沉淀变得澄清为止；（5）于4℃，12000 r/m，离心15min，取上清，得到AK的粗提液；2.2.5蛋白质的检测测AK的活性：新鲜配制测活底物，保存于4℃取5μl上清加入装有1mlAK下降值。
底物塑料比色皿迅速混匀，通过紫外分光光度法测A575SDS-PAGE电泳检验： 1）安装双垂直板电泳槽；2）配12%的分离胶15ml，浓缩胶5ml；3) 制样：取样品10µ1加样品缓冲液以40µ1混合，100℃加热5min ， 15000×g，4℃离心1 min；4）上样：用微量注射器加样15-20 µ1 ；5）电泳：在浓缩胶上加80V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140V/cm继续电泳直到染料到达底部；6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。
2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白Ni柱预处理：（1）用50mLStripping Buffer洗10min，水洗20min ；（2）用1.5mol/LNaOH和1mol/LNaCL30ml混合液洗15min,水洗20min；（3）用Binding Buffer洗15min,水洗20min；（4）用0.1MNiSO4洗15min,水洗20min平衡：用Binding Buffer平衡Ni柱。
滤光片，调A=0值、T=100值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检上样：插A280测系统，保存文档并按开始采集。
将粗提液60ml上柱，流速约为1.4ml/min 洗脱：上样完后，用Binding Buffer淋洗。
待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（10 mM、250 mM）洗脱，在280 nm处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。
分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。
3 结果与分析3.1蛋白质层析图谱图1 AK经Ni柱纯化的层析图谱由谱图可知：在上样前是用Binding Buffer平衡，上样后00:06—00:09曲线走向依然持平，说明此时流出液是Binding Buffer；00:09时曲线基本上以直线上升出峰，说明此时的穿流液中有大量的蛋白质（杂蛋白）；峰回落并基本持平后，分别用10mM、250mM咪唑洗脱，分别出峰，说明均有蛋白被洗脱下来。
3.2 AK诱导表达电泳图图2 SDS-PAGE电泳图由图可知：（1）第1道是上清液，即蛋白的粗体液。
有较强的目标蛋白带，同时也有许多杂带，说明上清液中有很多杂蛋白；（2）第2道是穿流液，除大量的与上清液相对应的杂蛋白带外，强带相比上清液浅，说明大部分AK已结合在Ni柱上;(3)第3道是10mM咪唑洗脱液，目标蛋白带较弱，说明较少AK被洗脱下来;(4)第4道是250mM咪唑洗脱液，目标蛋白带最强，说明大量AK被洗脱下来。
4总结我们以通过IPTG诱导精氨酸激酶基因在E.Coli菌株中表达，通过His-tag Ni 亲和层析法技术分离纯化得到较纯的活性精氨酸激酶，为精氨酸激酶结构与功能的研究提供基础。
诱导条件，层析系统的选择对以后的研究有着重要借鉴意义。
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