精氨酸激酶（AK）的提取与纯化报告题目精氨酸激酶（ＡＫ）的提取与纯化作者姓名徐青龙班级学号1005/2010114020208指导教师汪劲松完成时间2013年10月生物学实验教学中心目录１引言 (1)1.1精氨酸激酶（AK） (1)1.2亲和层析法 (2)1.3电泳法 (2)1.4本实验主要工作 (3)2.1实验用品 (3)2.1.1实验材料 (3)2.1.1实验试剂 (3)2.1.2仪器设备 (4)2.2方法 (5)2.2.1活化菌种 (5)2.2.2 扩大培养 (5)2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (5)2.2.4 蛋白质提取 (5)2.2.5蛋白质的检测 (6)2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (6)3 结果与分析 (7)3.1蛋白质层析图谱 (7)3.2AK诱导表达电泳图 (8)4总结 (9)参考文献 (10)致谢 (10)精氨酸激酶（AK）的提取与纯化朱景鹏（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学1005班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
本实验采取含有包含AK基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。
当菌体浓度A600达到0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的IPTG终浓度为0.2 mM ,诱导培养3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。
再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶[1]。
它的作用是催化可逆反应，将ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能健的储能分子——磷酸精氨酸[3]，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。
AK在体内催化反应方程式如下：Mg2+ + ADP + Arginine phosphate Mg2+ + ATP + Arginine AK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。
虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。
按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。
2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。
3.环节动物Sabellapavonina中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。
1.2亲和层析法依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。
配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。
但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。
当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。
特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。
所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。
His-tag所用层析凝胶的基质上连接了一个氨基三乙酸，可以与Ni离子结合，而Ni 离子与融合蛋白的6Xhis之间产生吸引力，从而将带有组氨酸标签的融合蛋白与其他蛋白区分开来。
加样后，用平衡液可以将杂蛋白洗脱下来，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可回收靶蛋白。
1.3电泳法电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。
蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。
凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。
一般凝胶介质中的pH 被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。
蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）,其作用是用于分离蛋白质和寡核苷酸。
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由Shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
1.4本实验主要工作1.4.1 从大肠杆菌Rosseta中得到精氨酸激酶的粗提液1.4.2 对精氨酸激酶粗提液通过Ni亲和层析进行进一步纯化1.4.3 对所得结果通过SDS-PAGE进行检测2材料与方法2.1实验用品2.1.1材料含有重组有AK基因质粒的表达菌体E. coli Rosetta2.1.2试剂LB液体培养基（100 mL）：蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，Nacl 1 g50 mg/mL 卡那霉素（kanamycin）IPTGBinding Buffer : Tris(20 mM)，Nacl(500 mM)，加Hcl调PH至8.0咪唑（10 mM、250 mM）12 %的分离胶（5 mL）:成分体积（mL）水 1.6030 %丙烯酰胺 2.001.5 M Tris (PH 8.8) 1.3010 % SDS 0.0510 % 过硫酸铵0.05TEMED 0.002浓缩胶（2 mL）成分体积（mL）水 1.4030 %丙烯酰胺0.331.0 M Tris (PH 6.8) 0.2510 % SDS 0.0210 % 过硫酸铵0.02TEMED 0.002样品缓冲液考马斯亮蓝R-2502.1.3仪器设备● YC-1型层析实验冷柜（北京博医康实验仪器司）；● CXG-1型电脑恒温层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司）；● TGL-16LA高速冷冻离心机（星科仪器厂有限公司）；● GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司）；● 超声破壁仪；（上海之信仪器厂有限公司）● 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）● 超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司）● SDS-PAGE电泳仪● 电子天平TE412-L，TE2101-L，CP64（德国Satorins公司）● BS-1E振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂)● SW-CJ-1FD单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）● 3FG-01B电热恒温鼓风干燥箱● 漩涡混合器XH-C（江苏省金坛市医疗仪器厂）● 高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）酒精灯、培养皿、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、离心管、恒温水浴锅等。
2.2方法2.2.1活化菌种取工程菌种50 µL装有6 mL的LB液体培养基的试管（含有6 µL卡那青霉素，其工作浓度为50 µg/mL）中。
于37℃摇床振荡培养8-12小时。
2.2.2 扩大培养将试管中活化的6 mL菌液接种到300 mL LB培养基，同时加入300 µL卡那青霉素（终浓度50 µg/mL）培养基于37℃恒温培养箱中培养2-3小时。
2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当OD=0.6-0.8时,加IPTG 150 μL至终浓度为0.2 mM时AK的表达量达到最大。
2.2.4 蛋白质提取（1）将上述各管于4℃，5000 r/m离心10 min；（2）弃上清，加入蒸馏水使沉淀物质重悬，再于4℃，6000 r/m离心10 min；（3）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g沉淀加5 mL裂解液使其重悬；（4）在冰上进行10 min,超声3 s，间隔为2 s的超声波破壁, 反复破壁直到沉淀变得澄清为止；（5）于4℃，12000 r/m，离心15 min，取上清，得到AK的粗提液；2.2.5蛋白质的检测SDS-PAGE电泳检验：1）安装双垂直板电泳槽；2）配12%的分离胶5 mL，浓缩胶3 mL；3) 制样：取样品10 µL加样品缓冲液以40 µL混合，100℃加热5 min ，15000×g，4℃离心1 min；4）上样：用微量注射器加样15-20 µL ；5）电泳：在浓缩胶上加60 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。
2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白Ni柱预处理：(1)用2 M盐酸胍10 mL与树脂打散混合洗涤，静置10 min；(2)用蒸馏水洗10 min；Stripping Buffer洗20 min；(3)用蒸馏水洗10 min；用0.3 M NaOH洗20 min；(4)用Binding Buffer洗20 min；蒸馏水洗10 min；(5)用1.5 M NaCl洗20 min；用Binding Buffer洗20 min；蒸馏水洗10 min;(6)Ni柱再生：→50 mL 0.1 M NiSO4洗蒸馏水洗(7)6倍柱床体积Binding Buffer（pH=8.0）平衡注：流速控制在2-3 mL/min。
平衡：用Binding Buffer平衡Ni柱。
上样：插A280滤光片，调A=0值、T=100值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。